产品目录

本制品适合于从培养的动物细胞或者细菌中快速提取总RNA。试剂盒基于硅胶柱纯化技术，提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提，整个提取过程只需30～40min。试剂盒采用膜过滤及DNase I消化，可更高效地去除基因组DNA，提取的总RNA纯度高，没有蛋白和其他杂质的污染，可直接用于RT-PCR、Northern Blot、Poly A纯化、核酸保护和体外翻译等实验。

• 安全低毒：无需酚、氯仿等有毒试剂。
  
• 操作简便：30～40min内完成数个样品的总RNA提取。
  
• 高效去除基因组DNA：采用膜过滤及DNase I消化，高效去除基因组DNA。
  
• RNA纯度高：提取的RNA无杂质残留，适用于对纯度、完整性要求很高的下游实验。

• 第一次使用前应在漂洗液GPW2中加入48mL的无水乙醇。
  
• 操作前在裂解液Buffer GBRL中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1mL裂解液GBRL中加入10μL β-巯基乙醇。此裂解液现配现用，加过β-巯基乙醇的GBRL置于2～8℃可保存一个月。裂解液GBRL在储存时可能会形成沉淀，若有沉淀出现，请加热溶解后使用。
  
• DNase I工作液的配制：2μL DNase I + 28μL DNase Buffer，轻轻吹打混匀，现用现配。
  
• 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染，经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌、汗液及RNase等，可能导致RNA降解。
  
• RNA在裂解液GBRL中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗、灭菌。
  
• 以下操作无明确指明，均在室温下进行。

• 收集细胞：
  
  • 悬浮细胞的收集（收集细胞数量不要超过1×10⁷）：估计细胞数量，300×g离心5min，将细胞收集到离心管中，仔细去除所有的培养基上清。
    
  • 单层贴壁细胞的收集（收集细胞数量不要超过1×10⁷）：可直接在培养容器中裂解（容器直径不超过10cm），或使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀（在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法）。
  
  
  • 直接裂解法：确定细胞数量，彻底吸除细胞培养基上清，立即进行第2步裂解步骤。
    
  • 胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸除培养基上清，用PBS洗涤细胞，吸除PBS，向细胞中加入含有0.10～0.25％胰蛋白酶的PBS处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至RNase-Free的离心管中，300×g离心5min，收集细胞沉淀中，仔细去除所有的上清。
    
    培养基上清去除不干净，将会导致裂解不充分，影响RNA与吸附柱的结合，造成RNA产量降低。
• 裂解处理：
  
  • 对于离心得到的细胞沉淀：轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加入适量的裂解液GBRL（详情见下表，使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），涡旋震荡混匀。
    

    沉淀细胞数量	裂解液GBRL
    ＜5×106	350μL
    5×106～1×107	600μL

    
    
  • 对于直接裂解的细胞：加入适量的裂解液GBRL（详情见下表，使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），将细胞裂解液转移到离心管中，涡旋震荡混匀。
    

    容器直径	裂解液GBRL
    ＜6cm	350μL
    6～10cm	600μL

• 将所有溶液转移至RNase-Free ColPure gDNA过滤柱中，12000rpm(~13400×g)离心2min，收集滤液。
  
• 向滤液中加入1倍体积的70％无水乙醇（通常为350μL或600μL），充分混匀（此时可能会出现沉淀），将得到的溶液和沉淀一起转入RNase-Free ColPure RNA吸附柱中，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
  
  配制70％无水乙醇时请使用RNase-Free ddH2O，如果滤液体积有损失，请相应调整乙醇的用量。
  
  
• 向吸附柱中加入350μL去蛋白液GRW1，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
  
• DNase I工作液配制：2μL DNase I+28μL DNase Buffer，轻轻吹打混匀。
  
• 向吸附柱中央加入30μL的DNase I工作液，室温放置15min。
  
• 向吸附柱中加入350μL去蛋白液GRW1，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
  
• 向吸附柱中加入500μL漂洗液GPW2（使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
  
• 重复步骤9。
  
• 12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温开盖放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液。
  
  此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT等实验。
  
  
• 将吸附柱放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30~100 μLRNase-Free ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液，将洗脱的RNA置于-80℃保存。
  
  洗脱液体积过小影响回收效率，柱子最小的洗脱体积是30μL。

• 4℃ 12000rpm(~13400×g)离心2min收集菌体（收集的菌体最大量不超过1×10⁹），仔细去除所有的培养基上清，后续所有离心步骤均在室温下（15～30℃）进行。
  
  如果培养基上清去除不干净，将会对第二步中的细胞壁消化产生抑制。
  
  
• 用含有溶菌酶的100μL的TE缓冲液（客户自己配制）彻底重悬菌体，孵育时间见下表。
  

  	TE缓冲液中溶菌酶的终浓度	孵育时间（室温）
  G-细菌	400μg/mL	3～5min
  G+细菌	3mg/mL	5～10min

  
  
• 加入350μL的裂解液GBRL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），涡旋震荡混匀。
  
  可选步骤：若出现不溶性沉淀，可在步骤4前先将样品于12000rpm离心2min，取上清再进行步骤4过滤。
  
  
• 将所有溶液转移至RNase-Free ColPure gDNA过滤柱中，12000rpm离心2min，收集滤液。
  
• 加入250μL的无水乙醇，充分混匀（此时可能会出现沉淀），将得到的溶液和沉淀一起转入RNase-Free ColPure RNA吸附柱中，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
  
• 向吸附柱中加入350μL去蛋白液GRW1，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
  
• DNase I工作液配制：2μL DNase I+28μL DNase Buffer，轻轻吹打混匀。
  
• 向吸附柱中央加入30μL的DNase I工作液，室温放置15min。
  
• 向吸附柱中加入350μL去蛋白液GRW1，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
  
• 向吸附柱中加入500μL漂洗液GPW2（使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
  
• 重复步骤10。
  
• 12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温开盖放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液。
  
  此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT等实验。
  
  
• 将吸附柱放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30~100 μLRNase-Free ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液，将洗脱的RNA置于-80℃保存。
  
  洗脱液体积过小影响回收效率，柱子最小的洗脱体积是30μL。

• 提取的RNA出现降解？
  
  • 样品用量过多。影响裂解液的裂解能力，造成RNase未被充分抑制，导致RNA降解，建议参考说明书推荐取样量，若要增加样品起始量，则后续实验中各溶液量均要按等比例增加。对于内源RNase含量较多的组织应减少样品量，适当增加裂解液用量。
    
  • 操作过程中引入RNase污染。请使用RNase-Free的工具、试剂和耗材。
    
  • 电泳过程中发生降解。使用RNase-Free的Loading Buffer、琼脂糖和电泳缓冲液等。
• RNA得率低？
  
  • 样品用量过多。样品过量会影响裂解效果，建议按照说明书要求适量取样。
    
  • 样品裂解不充分。请按照说明书的要求进行充分裂解。
    
  • 洗脱不充分。RNase-Free ddH2O需直接加到膜中央，并静置2min后再离心，必要时可进行二次洗脱以提高产量。
    
  • 吸附柱有乙醇残留。使用Buffer GPW2漂洗后需要开盖晾干吸附柱中的乙醇。
• 提取的RNA中有DNA污染？
  
  • 样品用量过多。超出试剂盒规定的样本量影响裂解液的裂解能力可能会导致基因组的污染。
    
  • 次生代谢物较多。次生代谢物含量高的样本在提取RNA时易出现基因组的污染。
    
  • 操作过程中需要进行去除基因组DNA的操作，若DNA含量较多，可延长DNase I消化时间或重复消化。