植物线粒体RNA提取试剂盒

产品货号：

KL221127

中文名称：

植物线粒体RNA提取试剂盒

英文名称：

Plant Mitochondrial RNA Extraction Kit

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1～3天

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本制品是专门用于植物细胞线粒体RNA纯化的试剂盒。

背景资料

植物线粒体是重要的植物细胞器，负责植物细胞ATP的产生。此外，植物很多重要的特性(如雄性不育)也跟线粒体相关，是母系遗传研究的重要材料，因此常常需要进行线粒体RNA纯化。

即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液或优化操作流程。
提供粗提和精提两种操作方案。粗提只需常规台式冷冻离心机，利用差速分离原理进行线粒体粗提，所得线粒体虽然含少量其他细胞器污染，但可用于线粒体RT-PCR，不能用于测序。
精提需要冷冻超速离心（离心力达40000g），利用密度梯度来将粗提制备的线粒体和其他细胞成分进一步分开，得到线粒体精提液，适用于后续测序级线粒体RNA提取。

包装	组分	规格
包装一	植物线粒体提取匀浆液	250mL
	植物线粒体提取洗涤液	250mL×2
	植物线粒体提取离心介质	150mL
	带柄尼龙筛	1个
	软毛笔	1只
	Percoll	50mL
	詹纳斯绿B染色液（0.2%）	1mL
	细胞器RNA纯化溶液A	5mL
	细胞器RNA纯化溶液B	1mL
	细胞器RNA纯化溶液C	5mL
包装二	25mM MgCl₂溶液	0.2mL
	0.5M EDTA溶液	1.5mL
	BSA干粉	10g
	DNase A干粉	5mg

保存：包装一置于室温，包装二置于-20℃，有效期1年。

规格说明

本试剂盒足够5次提取，每次可处理10g绿色植物组织（可得1～2.5mg左右线粒体）或20g非绿色植物组织（可得2～5mg左右的线粒体）。

超纯水、5M KOH(调pH用)、0.5M EDTA溶液、75%乙醇。

注意事项

线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用植物组织，器皿和溶液均需要在4℃预冷。任何情况下线粒体的温度都不要超过4℃。

一、准备工作

植物组织不同，线粒体产率不同，请以下表为参考：

植物组织种类	线粒体产率	说明
根和块茎	0.3mg/10g	如土豆，红薯等
黄化苗（下胚轴、子叶、胚芽鞘）	2～5mg/10g	指多酚含量低的叶片
有光合作用的叶片和子叶	1～2.5mg/10g	需放置在暗处3天

线粒体纯化最好选用黄化苗。如果用绿色组织（如叶片），需将植物提前放在暗室至少3天以降低淀粉含量，否则淀粉颗粒将严重干扰线粒体的纯化。
一次线粒体纯化实验需要10g绿色植物组织（或20g干净的非绿色植物组织）、40mL匀浆液、90mL洗涤液和35mL密度梯度离心介质。密度梯度离心介质的配制方法是一次性将9.8g（=8.7mL）Percoll加入到26.3mL离心介质中，充分混匀后得到35mL密度梯度离心介质。上述三种溶液（匀浆液、洗涤液和加入了Percoll的离心介质）用前均需要先加入0.1%BSA干粉（100mL溶液加0.1g BSA干粉），轻柔颠倒混匀溶解后放冰上预冷待用。每次实验用多少配多少，不要预先将所有BSA干粉加入。

二、线粒体粗提操作流程

将10g的绿色植物组织（去叶脉后的嫩叶子或愈伤组织）或20g干净的非绿色植物
组织（如发芽组织、根、块茎等）浸泡在冰水中10分钟，取出用纸吸干液体后浸泡在预冷的40mL匀浆液（已加BSA）中，在浸泡状态下剪成1cm2大小的碎片。
- 处理样品量太大的话，可能超出裂解液的裂解能力，线粒体产率会急剧降低，所以如果需要放量处理同一样品，可分成多个组平行处理，得到线粒体粗提物后再汇集。
将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到Waring匀浆器（打水果汁的匀浆器）中，中速匀浆3次，每次15秒，每次之间间隔10秒以便让碎片沉淀到刀片处。也可使用研磨法，具体操作是将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到预冷的研钵中，研磨3～4分钟。
- 植物组织匀浆后释放的物质会使匀浆液酸化，降低pH，而线粒体对pH变化非常敏感，因此建议匀浆后用pH试纸检测匀浆液的pH，如果低于7.0，必须用自备的5M KOH将pH调到7.0以上才进入下一步。
用试剂盒提供的带柄尼龙筛过滤匀浆液，穿透液可通过预冷的漏斗收集到预冷的50mL的塑料离心管中。本试剂盒提供的一个带柄尼龙筛可以洗干净后反复使用。
在低速固定角度冷冻离心机上4℃ 1000g离心匀浆液5分钟，上清含线粒体，沉淀为未破碎的细胞、破碎细胞的碎片、细胞核和淀粉颗粒等。小心转移上清到新的预冷的50mL塑料离心管中。
将含线粒体的离心管在水平冷冻离心机上4℃ 12000g离心20分钟，弃上清液，所得棕绿色沉淀即为纯化的线粒体粗提物。如果沉淀底部还有白色的淀粉沉淀，属于正常现象。
在沉淀中加入10mL预冷的洗涤液（已加BSA，下同）中，用软毛笔轻柔重悬线粒体沉淀(如果最底下有白色淀粉沉淀，避免重悬之)。不能剧烈震荡，否则线粒体容易破裂。本试剂盒提供的一只软毛笔可以洗干净后反复使用。
将线粒体重悬液转移到新的50mL离心管中，再加入30mL预冷的洗涤液，4℃ 1000g离心5分钟。线粒体将在上清中。
将上清转移到新的预冷的50mL离心管中，4℃ 12000g离心20分钟，沉淀为线粒体。小心弃上清。到此步时，线粒体回收率一般在15～30%之间。
在线粒体沉淀中加入2mL预冷的洗涤液。轻柔重悬，得到线粒体粗提液。如果有平行提取，可将最多4管线粒体沉淀重悬在2mL洗涤液中。
在显微镜下检测重悬液中线粒体的完整性。具体做法是先滴一滴（约50μL）线粒体粗提液到载玻片上，再滴入50μL 0.2%詹纳斯染液绿B染色液，混匀后20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
所得线粒体粗提液往往含其他细胞器（如类囊体膜，质体，过氧化物酶体，乙醛酸循环体，或细菌）污染，但可直接用于PCR级线粒体DNA和RNA的提取。如果需要长期保存，则直接放-80℃保存。如此保存的线粒体RNA完整性在几年内都不会变化。

三、细胞核DNA的去除（纯化测序级的线粒体RNA才需要进行此操作）

预留50μL线粒体粗提液作对照，在约2mL剩余的线粒体粗提液中加入40μL 25mM MgCl₂，再加入1mg DNase A干粉，混匀后冰上放置60分钟降解DNA。然后取50μL线粒体样品到一干净离心管中，剩下样品继续放冰上酶切DNA。将取出的50μL样品在PCR仪器中加热到95℃变性10分钟灭活DNase A，再取其中的1～10μL做模板，用1～10μL预留的线粒体粗提液做对照，一起进行细胞核基因专一性PCR（需要用户自己设计引物和自备PCR试剂），如果DNase A处理过的样品没有扩增，而预留样品有扩增，则表明基因组DNA去除比较干净（达到PCR检测的极限），则进入下一步。如果未去除干净，则继续在冰上放置，直到PCR检测不到细胞核DNA。
加入0.3mL预冷的0.5M的EDTA溶液终止反应。
再加入40mL预冷的洗涤液，4℃ 1000g离心5分钟，将上清转移到新的预冷的50mL离心管中。
将上步离心管放4℃ 12000g离心20分钟，沉淀为去除细胞核DNA之后的线粒体。重悬在2mL洗涤液中。
在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴50μL左右的线粒体重悬液到载玻片上，再滴入50μL 0.2%詹纳斯染液绿B染色液，染色20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。

四、线粒体精提操作方案（需要40000g的超速冷冻离心机）

在50mL预冷的塑料离心管中先后加入35mL预冷的密度梯度离心介质（配制方法见第3步，用前需先加BSA）。
将第18步所得的2mL线粒体粗提物重悬液铺在密度梯度离心介质上。
在超速水平离心机上4℃ 40000g离心45分钟，最上层为黄色或橙色的质体带（如果材料是绿色植物，此带将是绿色），其下的白色不透明的带即为线粒体，管底沉淀为过氧化物酶体。其示意图如下：
用广口吸管（可将1mL蓝抢头中间剪断后使用）收集线粒体带，注意避开其上的质体带过氧化物酶体沉淀，估计所取含线粒体带的体积。
在15～20分钟的时间内缓慢加入至少4倍体积的预冷的洗涤液。
转入50mL塑料管离心管中，在冷冻离心机上4℃ 15000g离心20分钟，沉淀为线粒体。可以直接进入第26步进行RNA提取。如果暂时不提取RNA，则把线粒体沉淀放-80℃保存。

五、线粒体RNA的提取

在上步所得的线粒体沉淀中加入1mL细胞器RNA提取溶液A，用移液枪充分吹打。
再加入200μL细胞器RNA提取溶液B，颠倒数次混匀。
室温放置5分钟。
14000g室温离心5分钟。小心转移上清液（约0.7mL）到一个新的1.5mL塑料离心管中，避免触及中间层的白膜。
加入1倍体积的细胞器RNA提取溶液C（用前颠倒摇晃均匀）到上清液中，用手上下颠倒30秒混匀。
14000g室温离心10分钟，小心弃上清。
在离心管中加1mL 75%乙醇，短暂震荡，14000g室温离心3分钟，弃上清。
短暂离心，小心吸弃残留的液体（约50μL）。此步不要省略，否则残留的液体（含乙醇）将会影响后续反应。
立即加入30μL超纯水充分溶解线粒体RNA沉淀。
直接取1μL在NanoDrop上测OD计算浓度和纯度，其余样品放-80℃保存备用。

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