产品货号:
KFS435
中文名称:
总RNA提取试剂(Trizol法)
英文名称:
产品规格:
20mL|50mL|100mL
发货周期:
1~3天
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TRIzol是一种快捷方便的总RNA提取试剂,可以从动物组织、各种微生物及细胞等中提取总RNA。在样品处理过程中,TRIzol可完全充分裂解样品,同时保持RNA的完整性。加入氯仿离心后,溶液形成上清层(水相)、中间层和有机相(下层)。取出上清层,可用异丙醇沉淀回收RNA;中间层用乙醇沉淀回收DNA;有机相可用异丙醇沉淀回收蛋白。
TRIzol试剂可用于少量样品的RNA提取,也可用于大量样品的RNA提取。提取RNA整个过程方便快速,整个操作过程可一个小时内完成,提取的RNA无蛋白和DNA的污染,纯度髙,可直接用于Northern Blotting、斑点杂交、polyA筛选、mRNA纯化、体外翻译、RNase保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。
组分 | 20mL | 50mL | 100mL |
总RNA提取试剂(Trizol法) | 20mL | 50mL | 100mL |
说明书 | 1份 |
保存:4℃,避光,有效期1年。
氯仿、异丙醇、75%乙醇(用DEPC处理过的水配制)、无RNase的无菌水。
RNA提取过程的关键是建立一个无RNase的实验环境,因此在整个操作过程中要防止RNase的污染,应注意以下几点应注意以下几点:
- 实验过程中经常更换新手套,使用专用超净台,在操作过程中避免讲话;
- 应尽量使用无RNase的实验器材;枪头、塑料制品和玻璃制品可以用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理过夜,然后在120℃下高压灭菌30min以去除残留的DEPC。玻璃制品也可用干热灭菌去除RNase(180℃烘烤2h);
- 配制溶液应使用无RNase水(无RNase水的配制方法:双蒸水加入DEPC至终浓度0.01% V/V,放置过夜,然后120℃下高压灭菌30min,备用);
- 整个实验过程中使用的试剂,实验器材和无RNase水应专用,避免交叉污染。
- 本试剂含强变性剂,应避免与皮肤接触,如接触皮肤,应立即用大量的水冲洗,根据需要情况到医院处理。本品含有酚类、巯基乙醇等成分,具有特殊气味,请于吸取试剂溶液后马上盖好瓶盖,或于通风橱中操作。
- 样品处理
- 贴壁培养细胞
① 倒净培养液;
② 每10cm2生长的培养细胞中加入1mL百奥莱博TRIzol试剂,在室温下水平放置5min,使裂解液均匀分布于细胞表面,然后用移液枪吹打细胞使细胞脱落;
③ 将细胞裂解液转移至离心管中,并用1mL枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀,在室温下放置5min,使得核酸蛋白复合物完全分离; - 悬浮培养细胞
① 直接离心收集细胞,倒净培养液;
② 细胞沉淀中每5~10×106细胞加入1mL百奥莱博TRIzol试剂;
③ 将细胞裂解液转移至离心管中,并用1mL枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀,在室温下放置5min,使得核酸蛋白复合物完全分离; - 动、植物组织材料
① 将组织在液氮中磨碎成粉末状(应无明显颗粒);
② 每50~100mg的组织加1mL百奥莱博TRIzol试剂,样品的体积不应超过TRIzol试剂体积的10%,并用匀浆器进行匀浆,直至匀浆液呈无颗粒透明状;
③ 将细胞裂解液转移至离心管中,在室温下放置5min,使得核酸蛋白复合物完全分离;
④ 12000g,4℃离心10min,然后小心吸取上清液,移入新的离心管中;
- 贴壁培养细胞
- 向上述步骤1得到的裂解液中加入氯仿(每使用1mL百奥莱博TRIzol加0.2mL氯仿),盖紧离心管管盖,用手上下振荡15s(请勿涡漩激烈振荡请勿涡漩激烈振荡),得桔红色浑浊液,无分层现象,室温静置3min;
- 12000g,4℃离心15min;
- 取出离心管,样品分为三层:黄色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相。小心吸取黄色上清水相移至另一离心管,水相的体积约为所用百奥莱博TRIzol试剂的60%;
- 向步骤4得到的上清水相加入等体积的异丙醇,轻轻混匀,室温静置10min;
- 12000g,4℃离心10min;
- 小心去除上清,缓慢沿管壁加入1mL75%的乙醇(用DEPC处理过的水配制),轻轻混匀。每使用1mL TRIzol
试剂至少加1mL 75%的乙醇; - 12000g,4℃离心10min;
- 小心吸尽上清;
- 室温干燥沉淀2~5min(不可晾得太干,否则RNA将会很难溶解),加入30~50μL的无RNase水溶解RNA沉淀,待完全溶解后于-70℃保存。取RNA样品用1×TE Buffer(见备注)稀释样品100倍或适当的倍数,测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的质量。
RNA的浓度=OD260×稀释倍数×0.04μg/μL,OD260/280在1.8~2.1视为抽提的RNA的纯度很高。
一般情况下每毫克的组织或1×106个细胞中所能提取的RNA量见下表:
组织材料 | TotalRNA提取量 |
上皮细胞 | 约10μg |
成纤维细胞 | 约6μg |
肝脏约 | 5μg |
肾脏约 | 3μg |
肌肉或脑 | 约1.5μg |
- 产率低
- 含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置,或静置的时间不足5分钟。
严格按照说明书操作。 - RNA不完全溶解。
缩短晾干时间。 - 三相分离时,吸取上清液不完全。
尽量回收上清液
- 含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置,或静置的时间不足5分钟。
- A260/A280<1.65
- 测定OD值时用的是水溶液。
更换测定OD值时的溶液,用TE Buffer。 - TRIzol加量太少,造成蛋白质变性不充分。
严格按照说明书操作。 - 含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置,或静置的时间不足5分钟。
严格按照说明书操作。 - RNA不完全溶解。
缩短晾干时间。 - 三相分离后,吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染。
小心吸取上清
- 测定OD值时用的是水溶液。
- RNA降解
- 使用的组织材料不够新鲜。
提取RNA的组织材料应采用新鲜的组织材料,或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存。 - 细胞用胰酶消化。
不要用胰酶消化细胞。 - 提取RNA时使用的试剂及器材中有RNase污染。
做好试验前的准备工作,保证无RNase污染。 - 提取的组织材料中含有大量的RNase。
加大TRIzol的用量
- 使用的组织材料不够新鲜。
- DNA污染
- 裂解组织或细胞使用的TRIzol量偏少。
加大TRIzol的用量。 - 使用的组织材料中含有大量的有机溶剂(如:乙醇、异丙醇等)、高浓度的Buffer、碱性溶剂等。
用DEPC水充分洗涤组织
- 裂解组织或细胞使用的TRIzol量偏少。
- 多糖的污染
- 多糖的理化学性质与RNA十分接近,因此很难将其从RNA中除去。
加大TRIzol的用量。
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