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本试剂盒可从同一样品中同时提取总RNA、基因组DNA和蛋白。DNA、RNA和蛋白提取前无需将样品分离。可从培养的真菌细胞、动物和植物组织中提取DNA、RNA和蛋白。

本试剂盒提供了一套独特的缓冲液系统和硅胶膜核酸纯化吸附分离柱技术，可分离纯化出基因组DNA和总RNA。无需苯酚/氯仿抽提。纯化的DNA可应用于限制性内切酶消化、PCR和其他后续分子生物学实验。提取的总RNA可用于mRNA分离、探针制备、RT-PCR、Northern blot、引物延伸、RNA酶保护实验和体外翻译等。

蛋白被一种能有效沉淀蛋白质的特殊缓冲液(PP Solution)以变性的形式纯化出来。洗涤步骤后，蛋白沉淀溶解于PD Solution。提取的蛋白可用于SDS-PAGE、Western Blot分析和定量。操作简单快速。不到1h时间内即可提取出基因组DNA、总RNA和蛋白质。

• 可同时提取出样品的基因组DNA、总RNA和蛋白质，时间不到1h。
  
• 提取的基因组DNA质量高，分子量≥20kb。
  
• 提取的总RNA质量高，无基因组DNA污染。
  
• 分离出的蛋白适用于SDS-PAGE和Western Blot分析。
  
• 得率高，重复性好。
  
• 无需苯酚/氯仿抽提或乙醇沉淀。

• 从动物组织中可纯化出最高10μg的基因组DNA。纯化的基因组DNA平均长度为20～30kb。这个长度的DNA特别适用于PCR，完全变性的模板对于高扩增效率非常重要。纯化的DNA可直接用于任何后续实验，包括：
  
  • PCR和real-time PCR
    
  • Southern,dot和slot blot分析
    
  • 比较基因组杂交(CGH)
    
  • 基因型分型，SNP分析
• 从动物组织中可纯化出最高20μg的总RNA。纯化的RNA可直接用于任何后续实验，包括：
  
  • RT-PCR
    
  • 实时荧光定量PCR
    
  • 差异显示
    
  • cDNA合成
    
  • Southern,dot和slot blot分析
    
  • 引物延伸
    
  • Poly A + RNA筛选
    
  • RNase/S1核酸酶保护
    
  • 微阵列
• 提取的蛋白为变性形式。纯化的蛋白可用于后续实验，比如：
  
  • 1D凝胶电泳
    
  • Western blotting

• 离心速度至少达到12000g的小型离心机
  
• RNase-Free的移液枪和枪头
  
• 涡旋混合器
  
• RNase-Free的乙醇(96～100%)
  
• 50%乙醇
  
• RNase-Free离心管(1.5mL)

• 样品采集和保存
  使用新鲜样品可获得最佳结果。从新鲜样品中纯化总DNA/RNA时，样品采集后立即将将新鲜的细胞和组织样品放入液氮或置于冰上。迅速将样品裂解或匀浆。
  如果样品使用前要先保存，应立即放入于液氮冷冻或放入RNA保存液(货号：GS2319)，然后于-80℃长期保存。保存的样品应避免反复冻融，因为这样会导致DNA/RNA的降解。
  
• 样品匀浆
  我们推荐用液氮处理组织样品，并立即用Buffer Lysis-DR/Buffer Lysis-DRP裂解样品。但是，使用匀浆机也会取得较好结果。
  样品采集和匀浆使操作应迅速，拿样品和试剂时应戴一次性手套，避免RNase污染。
  使用研钵、杵和铲子处理和转移样品时应预冷。加入Buffer Lysis-DR/Buffer Lysis-DRP前不要让组织样品解冻。
  
• 样品用量
  DNA/RNA的得率和质量取决于样品量。不可超过裂解液裂解能力和吸附膜的吸附能力。根据下表使用适量的原始材料：
  

  样品	含量
  肌肉组织	30mg
  肝或脑组织	20mg
  肾或脾组织	10mg
  培养的细胞	1×107
  植物组织	50mg

每次使用前检查Buffer Lysis-DRP是否出现沉淀。如出现沉淀，将溶液于56℃温浴使沉淀溶解，降至室温后再使用。

CE Buffer含10mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH9.0。后续实验如果要避免使用EDTA，最后一步可用水洗脱DNA。但是，pH小于7.0的水不推荐使用。

提供的CW1 Solution，CW2 Solution，GT Solution和NT Solution为浓缩液。第一次使用时，13mL CW1 Solution中应加入17mL乙醇，9mL CW2 Solution中应加入21mL乙醇，18mL GT Solution中应加入12mL乙醇，6mL NT Solution中应加入24mL乙醇，以配制成工作液。

1. 样品准备
   
   • 培养的细胞
     
     • 细胞悬液：将适当数量的细胞室温300g离心5min(最多1×10⁷个细胞)。小心吸走上清，进入步骤2。
       
     • 单层细胞：吸走培养基，加入350μL Buffer Lysis-DRP到细胞培养皿中。用细胞刮收集裂解液，将裂解液吸入离心管中。涡旋或吹打混匀，确保无可见的细胞团块，进入步骤3。
     • 如果不能立即提取样品基因组DNA，建议-80℃长期保存。
       
     • 保存的样品避免反复冻融，防止RNA降解。
   • 动物组织：取15～30mg动物组织，用液氮研磨成粉末。将冰冻的粉末转移至1.5mL RNase-free离心管中，使液氮挥发。
     
     • 若组织含细胞数量较多，比如脾，则样品用量不要超过10mg。
       
     • 加入Buffer Lysis-DRP前不要让组织样品解冻。
   • 植物：取25～50mg植物组织，用液氮研磨成粉末。将冰冻的粉末转移至1.5mL RNase-free离心管中，使液氮挥发。
     
     • 加入Buffer Lysis-DRP前不要让组织样品解冻。
2. 立即加入350μL Buffer Lysis-DRP到上述1.5mL RNase-Free的离心管中，涡旋混匀。室温放置5min。
3. 12000g，4℃离心3min，将上清转移到一个新的RNase-Free管中。

4. 将SD-10 DNA吸附柱放入2mL收集管中。将上述裂解产物加入到吸附柱后，室温静置1min，9000g室温离心1min。将收集管中的液体转移至新的RNase-Free管中，用于RNA的纯化。
   
   • DNA洗涤和洗脱前可将收集管中的液体保存于4℃或直接提取RNA(步骤11～17)。
5. 加入350μL Buffer Lysis-DRP到SD-10 DNA吸附柱，室温静置1min，9000g离心1min，倒掉收集管中的液体。
   
6. 将SD-10 DNA吸附柱放回收集管中，加入500μL CW1 Solution，室温静置1min，9000g离心1min，倒掉收集管中的液体。
   
   • 检查CW1 Solution是否已加入乙醇。
7. 将SD-10 DNA吸附柱放回收集管中，加入500μL CW2 Solution，室温静置1min，9000g离心1min，倒掉收集管中的液体。
   
   • 检查CW2 Solution是否已加入乙醇。
8. 将SD-10 DNA吸附柱放回收集管中，9000g室温离心2min。
   
9. 将吸附柱打开，室温静置2～3min，使乙醇彻底挥发。将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中。
   
   • 使SD-10 DNA吸附柱中的吸附膜干燥是非常必要的，因为残留的乙醇可干扰后续反应。这一步骤确保了在接下来的洗脱步骤中不会带入残留的乙醇。
10. 向SD-10 DNA吸附柱膜中央加入50μL CE Buffer，室温静置2min后9000g离心2min洗脱DNA。
    
    • 将CE Buffer加热至60℃可提高洗脱效率。
      
    • 使用超过50μL (比如100μL)的洗脱液可提高DNA得率，但浓度会降低。
      
    • 为获得最高的DNA得率，按步骤10再次洗脱。
      
    • 第二次洗脱时可使用新的离心管，以免第一次洗脱出的DNA浓度降低。

11. 加入250μL乙醇到步骤4收集管的液体中，充分混匀。
    
12. 将SR-10 RNA吸附柱放入收集管中，并将上述混合液转移到SR-10 RNA吸附柱，9000g室温离心1min。
    
13. 将收集管中的液体吸入一个新的1.5mL离心管中，用于蛋白质的纯化。
    
14. 将SR-10 RNA吸附柱放回收集管，加入500μL GT Solution，室温静置1min后9000g室温离心1min。倒掉收集管中的液体。
    
    • 检查GT Solution是否已加入乙醇。
15. 加入500μL NT Solution到吸附柱中，室温静置1min后9000g室温离心1min。倒掉收集管中的液体。
    
    • 检查NT Solution是否已加入乙醇。
16. 将吸附柱放回收集管中，9000g室温离心2min。
    
    • 使SR-10 RNA吸附柱的吸附膜干燥是非常必要的，因为残留的乙醇可能会影响后续反应。这一步骤的离心确保了在接下来的洗脱过程中不会有残留的乙醇。
17. 将吸附柱放入一个新的RNase-Free离心管中，加入30～50μL RNase-Free的水，室温静置2min，9000g离心2min。
    
    • 离心管中的溶液为RNA样品，可直接用于后续分子生物学实验或保存于-70℃。

18. 向步骤13的离心管中加入600μL PP Solution，彻底混匀，室温静置10min以沉淀蛋白质。
    
19. 9000g室温离心10min，小心吸走上清液。
    
20. 加入500μL 50%的乙醇到蛋白质沉淀中，9000g离心1min，尽量吸净上清。
    
    • 50%的乙醇洗涤蛋白时，用枪吹打几次沉淀。
21. 室温下干燥蛋白5～10min。
    
22. 加入最多100μL PD Solution并彻底混匀，溶解蛋白质。
    
23. 95℃孵育5min使蛋白彻底溶解并变性。再将样品冷却至室温。
    
24. 9000g离心2min，使残留的不容物质沉淀出来。
    
25. 将上清转移至新的1.5mL离心管中。
    
    • 离心管中为蛋白质溶液，可直接用于后续实验如SDS-PAGE和western blotting或保存于-20℃。

• DNA中有RNA污染。
  
  • 最终的匀浆液中pH应为7.0，确保样品不会过酸或过碱。
    
  • 用Buffer Lysis-DRP或Buffer Lysis-DR洗涤SD-10 DNA吸附柱一次，除去RNA污染。
    
  • 直接将RNase加入到DNA洗脱液中。
• DNA得率低。
  
  • 将组织样品彻底匀浆。可用液氮或匀浆机处理组织样品。
    
  • 使用适当量的样品。DNA得率取决于样品的类型、大小、年龄和保存方法。一些DNA含量低的植物组织请提高样品量。
    
  • 请检查CW1 Solution和CW2 Solution是否已加入乙醇稀释。
    
  • 请严格参照说明书对样品进行洗脱。参考说明书提供的注意事项。
    
  • 避免SD-10吸附柱中吸附膜过于干燥。将SD-10吸附柱室温静置3～5min使吸附膜干燥。切勿长时间将吸附膜置于室温或65℃。
• RNA中有DNA污染。
  
  • 减少原始材料用量。
    
  • 对于一些DNA含量非常高的组织(比如胸腺)，部分DNA会吸附不上SD-10 DNA吸附柱。请尝试使用更少的样品。
    
  • 未完全去除细胞培养基或稳定剂。
• RNA得率低
  
  • 我们推荐使用新鲜样品。
    
  • 将组织彻底匀浆。用液氮或匀浆机处理样品。
    
  • 使用适量的样品。RNA得率取决于样品的类型、大小、年龄和保存方法。请参考说明书的推荐用量。
    
  • 检查GT Solution和NT Solution是否已加入无水乙醇。
    
  • 请严格参照说明书对样品进行洗脱。
• RNA降解
  
  • 使用新鲜样品。如果是冻存的样品，确保样品是取样后立即冷冻于液氮并合理保存于-70℃的样品。
    
  • 我们推荐用液氮处理组织样品，并立即用Buffer Lysis-DR/Buffer Lysis-DRP裂解样品。
    
  • 在RNase-Free的环境中操作。
    
  • 所有操作步骤中都佩戴手套。经常更换手套。
    
  • 推荐使用RNase-Free的离心管。
• 吸附步骤中样品成团。
  
  • 确保样品加入吸附柱前已被彻底匀浆。
    
  • 样品加入吸附柱前12000g离心3min除去纤维和细胞碎片。
    
  • 减少样品使用量。根据说明书使用适量大小的样品。
    
  • 检查Buffer Lysis-DRP或Buffer Lysis-DR，如果保存过程中出现沉淀，加热至56℃使沉淀溶解。
• 抑制后续实验。
  
  • 来源于CW2 Solution的残留乙醇会抑制后续实验的酶促反应。吸附柱12000g离心2min，开盖后室温静置3～5min，使SD-10吸附膜上残留的乙醇彻底挥发。
    
  • 残留盐离子会抑制后续实验的酶促反应。确保洗涤步骤在室温(15～25℃)下操作。
• 蛋白沉淀难以溶解
  
  • 用移液枪吹打几次将沉淀悬浮或扰动。短暂离心后取取上清用于后续分析。
    
  • 有几种蛋白难以溶解，特别是膜蛋白。为提高溶解性，可根据您感兴趣的蛋白使用含其他去垢剂的悬浮缓冲液。
    
  • 为更好地溶解蛋白，将蛋白沉淀溶解于5% (w/v) SDS或8M尿素，或者提高PD Solution体积。
• SDS-PAGE中蛋白图谱不清晰
  
  • 用50%乙醇洗涤蛋白沉淀时，用枪吹打沉淀几次。
    
  • SDS-PAGE质量可受到与蛋白质量无关的几个参数的影响。改变蛋白上样量或凝胶的聚丙烯酰胺浓度(根据您感兴趣的蛋白分子量)。上样前样品46℃温浴10min (而不是95℃)可提高分辨度。