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本制品是一种新型的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能在迅速裂解细胞或组织的同时灭活细胞释放出的核酸酶，保持RNA的完整性。TotalRNAExtractor试剂适用于从人、动物、植物、真菌、细菌等各种组织或细胞中快速分离总RNA，既用于小量样品（50～100mg组织、5×10⁶细胞），也可用于大量样品（≥1g组织/≥10⁷细胞）。可同时处理大量不同样品。提取的总RNA质量高，可用于Northern blot、Dot blot、polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆。

• 适用范围广。
  
• 操作简单快速，整个过程1小时左右完成。
  
• 纯度高，污染少。

• 自备试剂：无水乙醇、氯仿、异丙醇等。
  
• 去酶处理：RNase是导致RNA降解最主要的物质，非常稳定。在一些极端的条件可暂时失活，限制因素去除后又迅速复性。常规的酸、碱以及加热方法不能使RNase完全失活。RNase广泛存在于人的皮肤上和体液及环境中，因此制备RNA时必须经常更换手套，同时戴上一次性口罩和卫生帽，并保证环境清洁。塑料制品、玻璃和金属物品、实验仪器等可以使用百奥莱博的固相表面RNase清除剂(货号：GS2320)，对于实验试剂的处理可以使用百奥莱博的液相RNase清除剂(货号：GS1945)。
  
• 样品保存：匀浆后，加氯仿前，样品可在-70℃放置一个月以上；提取的RNA样品可以在70%酒精中-20℃保存2个星期以上；如果需要长期保存，请置超低温冰箱中保存。

• 植物组织及真菌：取新鲜样品在液氮中充分研磨，也可以将样品剪碎后直接在TotalRNAExtractor中研磨。约100mg样品使用1mL TotalRNAExtractor。
  
  • 研磨要迅速，最好不要超过1分钟。
• 动物组织：取新鲜或-70℃冻存组织，每30～50mg组织在液氮中充分研磨，也可以加入1mL TotalRNAExtractor，用匀浆器匀浆处理。
  
  • 样品体积一般不要超过TotalRNAExtractor体积的10%。
• 单层培养细胞的收集：可直接在培养容器中裂解（培养面积不超过10cm²，细胞不超过1×10⁷），或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。
  
  • 直接裂解法：直接在培养板中加入TotalRNAExtractor裂解细胞，每10cm²面积加1mL TotalRNAExtractor。用移液器吹打混匀。
    
    • TotalRNAExtractor加量根据培养板面积决定，而不是由细胞数决定，如果加入的量不够，将导致提取的RNA中有基因组DNA污染。
  • 胰蛋白酶处理法：收集细胞并大致确定细胞数量，用PBS洗涤细胞后，向细胞中加入含有0.1～0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞，当细胞脱离容器壁后，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至无RNase的离心管中，8000rpm离心5min，收集细胞沉淀，去除上清。每10cm²面积加1mL TotalRNAExtractor。用移液器吹打混匀。
    
    • 收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则裂解不完全，降低RNA得率。
• 细胞悬液：离心收集细胞。每5×10⁶～10⁷动物、植物和酵母细胞或每10⁷细菌细胞加入1mL TotalRNAExtractor。
  
  • 加入TotalRNAExtractor前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
    
  • 对于难以裂解的酵母和革兰氏阳性菌需要液氮研磨或匀浆器匀浆。
• 血液处理：取0.5mL新鲜或冻溶的血液，12000rpm离心5min，去除血浆，加入1mL TotalRNAExtractor，充分振荡混匀。

• 将裂解后样品或匀浆液室温放置5～10min，使得核蛋白与核酸完全分离。
  
  • 样品中如含有较多的蛋白质、多糖、脂肪或其他细胞外基质，可以12000rpm离心10分钟，移去漂浮的油脂，取上清。
• 加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min。12000rpm 4℃离心10min。
  
  • 如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2分钟。
    
  • 样品会分成三层：上层水相，中间层和下层有机相。RNA在上层水相中。
• 吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20min。
  
  • 不要吸取任何中间层物质，否则会出现染色体DNA污染。
• 12000rpm 4℃离心10min，弃上清。
  
  • 离心前RNA沉淀通常是不可见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
• 加入1mL 75%乙醇洗涤沉淀。12000rpm 4℃离心3min，弃上清。室温干燥5～10min。
  
  • 75%乙醇用DEPC处理过的水配制。
    
  • 通常1mL TotalRNAExtractor需用1mL 75%乙醇洗涤沉淀。
    
  • 不要倒出沉淀，剩余少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，不要吸沉淀。
    
  • 不要晾的过干，RNA完全干燥后很难溶解，大约晾干5分钟左右。
• 加入30～50μL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA。将所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续试验。
  
  • 对于肝、胰腺、肾等组织中RNase含量很高，沉淀用100%去离子甲酰胺溶解。

• 测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的质量。按1OD=40μg RNA计算RNA的产率。OD260/280在1.8～2.0视为抽提RNA的纯度很高。浓度在4μg/mL以上的样品适于用分光光度计测定。
  
• 进行甲醛变性琼脂糖电泳，确定RNA的完整性和污染情况。

• 提取的RNA量较少
  
  • 样品裂解或匀浆处理不彻底，RNA没有被完全释放出来。
    
  • 得到的RNA沉淀未完全溶解。
• RNA样品的A260/A280值小于1.6
  
  • 检测吸光度时，RNA样品用水溶解不用TE。低离子浓度和低pH条件下，A280值会偏高。
    
  • 样品匀浆时加的试剂量太少，RNA与蛋白质，DNA不能够完全分离。
    
  • 匀浆后样品未在室温放置5分钟，RNA与核蛋白未完全解离。
    
  • 水相中混有有机相，从而带有蛋白质和DNA污染。
    
  • 抽提得到的RNA沉淀未完全溶解。
• 提取RNA样品发生部分或完全降解
  
  • 所用组织或细胞不新鲜，样品没有被及时液氮冻存，导致组织或细胞中的RNA降解。建议使用组织RNA室温保存液(货号：GS2319)等保存未能够及时提取的组织或细胞。
    
  • 细胞在胰蛋白酶时消化过长，导致未加TotalRNAExtractor前RNA已经部分降解。
    
  • 溶液或离心管未经RNase去除处理，RNase的污染导致RNA被降解。
    
  • 电泳时使用的甲酰胺pH小于3.5，导致RNA发生酸解。
• RNA样品中存在DNA污染
  
  • 样品匀浆时加的试剂体积太少导致，如果已存在DNA污染，可用非酶DNA清除剂A(货号：GS2311)去除。
    
  • 样品中含组织溶剂（如乙醇等）或碱性溶液，致水相减少或pH升高。
• RNA样品中存在蛋白和多糖污染
  
  • 样品中蛋白、多糖含量高或样品量太大，细胞未裂解完全。
    
  • 水相中混有有机相，从而带有蛋白质和DNA。