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mRNA只占细胞总RNA的3%左右，但却是最重要的RNA，因为它们编码蛋白质。因此构建cDNA文库、蛋白质体外翻译和RT-PCR检测等研究常常都需要从总RNA中先分离mRNA。真核mRNA带有poly(A)尾巴，所以可以通过与Oligo(dT)纤维素的亲和结合而与其他97%左右的非编码RNA(如rRNA、tRNA等)分离开。本制品就是基于此原理开发的、专门用于从总RNA中提取mRNA的试剂盒。

• 一站式，即开即用，非常方便。
  
• 一次可以处理约10～15μg总RNA，从中可得0.1～0.5μg左右的mRNA。
  
• 每克Oligo（dT）纤维素可以吸附50～80 OD的mRNA，相当于2000～3000μg mRNA。
  
• 只需要离心就可以完成，免去了常规的灌柱、洗柱等繁琐操作。
  
• 得到的mRNA可以直接用于构建cDNA文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR。

• 涡旋震荡取Oligo -dT纤维素悬液，迅速取50μL Oligo -dT纤维素悬液（相当于5mg干粉）到1个新的1.5mL离心管中，剩余的Oligo-dT纤维素重悬液放4℃长期保存。
  
• 洗涤：在50μL的Oligo -dT纤维素重悬液中加入0.5mL mRNA/Oligo-dT结合液（以下简称结合液）混匀，10000g离心3分钟，去上清。
  
• 在Oligo -dT纤维素沉淀中加入0.5mL结合液，吹打混匀，10000g离心3分钟，去上清，所得Oligo -dT纤维素沉淀待用。
  
• 将自备的总RNA取100μL 65℃保温5分钟，以打开mRNA可能的二级结构。未用的总RNA-80℃保存作为未处理的对照。如果总RNA体积不足100μL，则用RNase-free水补足到120μL并混匀，留20μL做作为未处理的对照，剩下的100μL 65℃保温5分钟。
  
• 保温结束后立即加入等体积（100μL）的结合液，用移液抢充分吹打混匀。
  
• 将混合液全部转移到第2步所得的Oligo-dT纤维素沉淀中，用移液抢充分吹打重悬Oligo-dT纤维素，室温放置5分钟。期间吹打混匀或者涡旋混匀数次以便让mRNA与Oligo-dT纤维素充分结合。
  
• 室温10000g离心5分钟，小心将上清转移到一个新的离心管中。此上清液是去除了mRNA后的总RNA，-80℃保存作为后续分析时的无mRNA对照。如果mRNA回收失败，可以再次将其用于mRNA纯化。
  
• 洗涤：加入0.5mL结合液，混匀后4℃ 10000g离心5分钟，小心弃上清。
  
• 重复上步3次。
  
• 加入50μL冰上预冷的RNase-free水，充分吹打混匀后4℃ 10000g离心5分钟，小心收集上清（mRNA）。
  
• 重复上步1次。
  
• 将两次收集的mRNA混合，即为100μL mRNA溶液。
  
• 由于mRNA只占总RNA的3%左右，100μg总RNA最多只能得到3μg mRNA，溶解在100μL水中，浓度也只有30ng/uL。所以如果需要浓缩mRNA，可以按下面附1操作进行。本试剂盒含相关试剂。
  
• 第11步剩下的Oligo-dT纤维素可以再生后重复使用。一般可以重复使用至少5次。再生的流程见附录2。本试剂盒含部分相关试剂。

15. 将微量核酸充分摇匀（静止太久有沉淀，属于正常现象），立即取200μL与100μL mRNA溶液混合。
    
16. 室温15000g离心10分钟。
    
17. 弃上清，小心不要吸走沉淀（mRNA）。
    
18. 加入自备的75%乙醇1mL，振荡10秒混匀。
    
19. 15000g离心3分钟，弃上清，小心不要吸走沉淀（mRNA沉淀）。
    
20. 再短暂离心后小心吸弃残留上清（约50μL）。
    
21. 沉淀即为回收的mRNA沉淀，不要长期放置（否则晾干太长时间mRNA不容易溶解），立即加入适量的RNase-free水溶解mRNA。mRNA可用于后续实验，或放-80℃保存。

22. 加入1mL 0.3mol/L的NaOH到第12步取走mRNA上清后剩下的Oligo-dT纤维素沉淀中，吹打重悬后室温放置5分钟，此步可以降解所有残留的RNA。
    
23. 离心吸弃NaOH溶液。
    
24. 用结合液洗涤Oligo-dT纤维素直到pH变成中性（用pH试纸检测）。
    
25. 加入250μL Oligo-dT纤维素保存液放4℃长期保存。
    
26. 用前需离心去掉Oligo-dT纤维素保存液。
    
27. 用结合液洗涤3次。
    
28. 重悬在100μL结合液中，然后切入到第3步。