产品目录

本试剂盒适用于植物组织细胞总RNA的大量提取，在无苯酚、氯仿RNA快速提取技术基础上，又采用基因组DNA清除柱技术可以有效清除gDNA残留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可直接用于PCR、荧光定量PCR等实验。独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，植物RNA助提剂帮助结合多糖多酚并通过离心去除，然后裂解混合物用乙醇调节RNA结合吸附到基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA被选择性洗脱滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase-free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

• 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
  
• 不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
  
• 快速，简捷，单个样品操作一般可在60分钟内完成。
  
• 独有的植物RNA助提剂可以有效结合多糖多酚，提高清除效果。
  
• 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

• 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
  
• 不合适的储存于低温（4℃或-20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15～25℃）进行。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇!
  
• 所有的离心步骤均可在室温完成，使用可容纳50mL离心管的离心机。
  
• 需要自备乙醇，一次性注射器（可选），研钵。
  
• 裂解液RLT和裂解液RLT Plus和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，需要用大量清水或者生理盐水冲洗。
  
• 植物组织裂解是否充分直接影响到RNA提取的质量和产量，本试剂盒中提供的裂解液RLT，主要成分为异硫氰酸胍，适用于大多数植物组织的裂解，但有些植物组织（例如玉米的乳白色胚乳）或丝状真菌，由于次级代谢产物较特殊，异硫氰酸胍使样品产生固化，导致RNA无法提取，此时可以向我们索取另一种裂解液RLC，将解决该问题。
  
• 关于DNA的微量残留：一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留，本试剂盒采用了独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时应注意以下几点。
  
  • 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
    
  • 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
    
  • 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁，请联系我们索取具体操作说明书。
    
  • 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
• RNA纯度及浓度检测：
  
  • 完整性： RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%～80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
    
  • 纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数（10mM Tris,pH7.5）在1.8～2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris(pH7.5)溶液中测出的OD260/OD280读数1.8～2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5～1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
    
  • 浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260,OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μL）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

• 直接研磨法（推荐）：
  
  • 新鲜植物组织称重后取1～2g迅速剪成小块放入研钵（冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取1～2g放入研钵），加入10体积（10mL）RLT和1体积（1mL）PLANTaid室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLT立刻充分接触以抑制RNA酶活性。
    
    • PLANTaid是提取多糖多酚含量丰富的困难样品不可缺少成分。普通植物组织可不加PLANTaid，RNA产量可能会提高一些。
  • 将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，10000～13000×g离心10分钟（如果离心机转速低，可适当延长离心时间），沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid，小心取裂解物上清（需计算体积）转到一个新离心管。
    
  • 加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即剧烈振荡混匀，不要离心。
    
  • 立刻接操作步骤项下3。
• 液氮研磨法：
  
  • 取10mL裂解液RLT，转入50mL离心管中，加入1mL PLANTaid混匀备用。
    
  • 液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取1～2g细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管，立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解。
    
    • 在56℃温育1～3分钟有助于裂解植物，但是淀粉含量高的植物不能温育，因为提高的温度可能导致淀粉膨胀。
  • 用带钝针头的一次性5mL(配0.9mm针头)注射器抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
    
  • 将裂解物10000～13000×g离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid，将所有裂解物上清转到一个新离心管。
    
  • 较精确估计裂解物(上清)体积，加入0.5体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即剧烈振荡混匀，不要离心。
    
  • 立刻接操作步骤项下3。
• 将混合物加入一个基因组清除柱中（吸附柱放入收集管中）10000～13000×g离心5分钟（确保全部通过，膜上无残留液体，否则应加大转速和时间），弃掉废液。
  
• 将基因组DNA清除柱子放在一个干净50mL离心管内（不用RNase-free或者DEPC处理，一般干净的新离心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干净收集管），在基因组清除柱内加5mL裂解液RLT Plus，13000rpm离心2分钟，收集滤液（RNA在滤液中）加用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为4～5mL左右，滤过时候损失体积应该减去），加入0.5倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
  
• 将混合物加入一个RNA吸附柱RA中（吸附柱放入收集管中）10000～13000×g离心5分钟（确保全部通过，膜上无残留液体，否则应加大转速和时间），弃掉废液。
  
• 加6mL去蛋白液RW1，室温放置1分钟，12000×g离心3分钟，弃掉废液。
  
• 加入10mL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），10000～13000×g离心1～2分钟，弃掉废液。加入10mL漂洗液RW，重复一遍。
  
• 将吸附柱RA放回空收集管中，13000×g离心5分钟以干燥膜基质残留乙醇，用枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇，室温或者烘箱晾干几分钟。
  
• 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加500μL～1mL RNase-free H2O（事先在70～90℃水浴中加热效果更好），室温放置3分钟，12000×g离心2分钟。
  
• 如果预期RNA产量>0.6mg，加300～500μL RNase-free H2O重复步骤9，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
  
  • 洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15～30%，但是浓度要低，根据需要选择。