富纤维组织RNA提取试剂盒()

产品货号：

ALH031

中文名称：

富纤维组织RNA提取试剂盒()

英文名称：

RNA extraction kit for fibrous tissue

产品规格：

50T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本试剂盒适用于快速提取心脏、骨骼肌、血管、气管、皮肤和其它纤维丰富的组织RNA。独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
快速、简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。
多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

组分	规格
裂解液RLT	50mL
去蛋白液RW1	40mL
漂洗液RW	10mL
RNase-free H2O	40mL
蛋白酶K(20mg/mL)	20mg
吸附柱和收集管	50套

所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
不合适的储存于低温（4℃或者-20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15～25℃）进行。
蛋白酶K保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输。收到后，不超过25℃室温可保存6个月，4℃保存1年，-20℃保存两年。
避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

第一次使用前请先在10mL漂洗液RW瓶中加入42mL无水乙醇!
所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，
如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
需要自备乙醇，β-巯基乙醇，一次性注射器，研钵，水浴锅等。
裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
预防RNase污染，应注意以下几方面：
- 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
- 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
- RNA在裂解液RLT中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
- 配制溶液应使用无RNase的水。
  - 将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。
关于DNA的微量残留：
一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留，本试剂盒采用独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时注意以下几点。
- 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
- 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
- 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁，请联系我们索取具体操作说明书。
- 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
RNA纯度及浓度检测：
- 完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%～80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
- 纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数（10mM Tris,pH7.5）在1.8～2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris(pH7.5)溶液中测出的OD260/OD280读数1.8～2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5～1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
- 浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260,OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μL）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1mL RLT中加入10μL β巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。

充分破碎匀浆（非常重要，否则严重降低产量）
- 电动破碎匀浆（首选强烈推荐，产量最高结果最稳定）：取约10～20mg（<30mg）新鲜组织，加入300μL裂解液RLT后用电动刀片匀浆机（Rotor-Stator如TissueRupter）或者电动玻珠研磨机（Bead Mill如TissueLyser）按照机器使用说明彻底破碎匀浆组织细胞。
- 液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉10～20mg（<30mg）转入装有300μL裂解液RLT的1.5mL离心管中，用手剧烈振荡20秒，充分裂解。用带钝针头的一次性1mL(配0.9mm针头)注射器抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。讲匀浆转入新离心管。
- 研钵研磨匀浆：取适量组织细粉10～20mg（<30mg）放入小研钵后，迅速加入300μL裂解液RLT后直接室温充分研磨匀浆。将匀浆转入新离心管。
  - 如果匀浆沾在研钵内损失比较大，可以按照比例适当提高起始组织用量和裂解液RLT用量。此外，也可以先用液氮研磨组织成细粉，然后液氮刚刚蒸发完的时候加入裂解液RLT充分研磨匀浆，可以提高研磨效果。
吸取590μL RNase-free H2O至匀浆中。加入20μL蛋白酶K，移液器吹打混匀。
55℃下水浴10分钟。
室温下以13000rpm离心5分钟。这样将会形成小量的组织碎片沉淀，而且在上清的顶部可能看见少量的漂浮物。
转移上清至一个新的1.5mL离心管中。
- 转移时不要带入沉淀物，而且移液枪头必须放在上清漂浮物之下。漂浮物通常可能会黏附在枪头的外壁，注意不能将其带入离心管中。
较精确估计裂解物(上清)体积，加入0.5体积的无水乙醇（一般为450μL），此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
立刻将混合物(每次小于700μL，可以分两次加入)加入同一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心60秒，弃掉废液。
加700μL去蛋白液RW1，室温放置30秒，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
- 如果DNA残留明显，可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。
加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍。
将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
取出吸附柱RA，放入一个RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30～50μL RNase-free water（事先在70～90℃水浴中加热可提高产量），室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。
可选：使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液RNA浓度可以适当提高一些。如果预期RNA产量>30μg，可加30～50μL RNase-free water重复步骤11，合并两次洗脱液，可以提高产量15～30%，但浓度会有所降低。

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