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本试剂盒适用于快速提取细菌总RNA，采用独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase-free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

• 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
  
• 不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
  
• 快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。
  
• 多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

• 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
  
• 不合适的储存于低温（4℃或-20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15～25℃）进行。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
  
• 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
  
• 需要自备乙醇。
  
• 裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
  
• 预防RNase污染，应注意以下几方面：
  
  • 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
    
  • 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
    
  • RNA在裂解液RLT中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
    
  • 配制溶液应使用无RNase的水。
    
    • 将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。
• 关于DNA的微量残留：
  一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留，本试剂盒采用了独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时应注意以下几点。
  
  • 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
    
  • 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
    
  • 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁，请联系我们索取具体操作说明书。
    
  • 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
• RNA纯度及浓度检测：
  
  • 完整性： RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%～80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
    
  • 纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数（10mM Tris,pH7.5）在1.8～2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris(pH7.5)溶液中测出的OD260/OD280读数1.8～2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5～1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
    
  • 浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260,OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

• 离心收集1～2mL菌液(10⁸～10⁹细胞)到一个1.5mL离心管，尽可能去除上清，注意残留的上清不能超过20μL/每使用100μL TE(见下面步骤2)。
  
• 根据细胞的种类和数量，充分重悬细胞在100μL(5×10⁸细胞)/200μL(5～7.5×10⁸细胞) TE Buffer(已加入溶菌酶或者lysostaphin，浓度为1mg/mL)中，或者直接用TE Buffer（10mM Tris-HCl,1mM EDTA）重悬后，用干净枪头挑取少许溶菌酶加入。
  
• 室温(15～25℃)温育5分钟/溶菌酶，或者37℃温育15分钟/lysostaphin，破解细胞壁。每2分钟涡旋振荡10秒帮助破壁。
  
  • 各种细菌破壁的难易程度不一样，一般革兰氏阴性菌使用上面的条件就足够了，甚至可能省略该步骤，但是某些阳性难破壁需要提高溶菌酶浓度或者使用lysostaphin，玻璃珠机械破壁，蛋白酶K消化或者联合使用等方法，需要根据用户自己的具体情况调节酶的工作浓度和温育温度、时间和选择正确的方法。
• 加入350μL（如果上面使用100μL TE/酶）或者700μL（如果上面使用200μL TE/酶）裂解液RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。
  
  • 一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物，极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13000rpm离心3分钟，沉淀不能裂解的碎片或者不溶物，将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。
• 加入250μL 96～100％乙醇（曾加入100μL TE/350μL RLT管）或者500μL 96～100％乙醇（曾加入200μL TE/700μL RLT管），立即吹打混匀。
  
• 立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心60秒，弃掉废液。
  
• 加700μL去蛋白液RW1，室温放置30秒，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
  • 如果DNA残留明显，可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。
• 加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍。
  
• 将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30～50μL RNase-free water（事先在70～90℃水浴中加热效果更好），室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。
  
• 如果预期RNA产量>30μg，加30～50μL RNase-free water重复步骤10，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
  
  • 洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15～30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。