产品货号:
ALH019
中文名称:
组织细胞总RNA提取试剂盒(去除gDNA)
英文名称:
Total RNA Extraction Kit From Cell & Tissue
产品规格:
50T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒适用于快速提取普通动物细胞和易裂解动物组织总RNA,使用独特的基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留,不需要使用DNase消化,RNA可直接用于反转录荧光定量PCR,Northern-blot等下游实验。
本试剂盒采用独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶,然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱,基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
- 完全不使用有毒的苯酚、氯仿、β巯基乙醇等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
- 快速,简捷,单个细胞样品操作一般可在15分钟内完成。
- 基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留,得到的RNA不需要DNase消化。
- 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达2.1-2.2。
组分 | 规格 |
裂解液RLT Plus | 50mL |
去蛋白液RW1 | 40mL |
漂洗液RW | 10mL |
RNase-free H2O | 10mL |
70%乙醇 | 9mL RNase-free H2O |
基因组DNA清除柱和收集管 | 50套 |
RNase-free吸附柱RA和收集管 | 50套 |
保存:室温,有效期1年。
- 所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。
- 不合适的储存于低温(4℃或-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温(15~25℃)下进行。
- 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
- 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13000rpm的台式离心机即可。
- 样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力,否则造成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大,例如胸腺脾脏DNA含量丰富,超过5mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富,超过3~106细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时,如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量,如细胞不超过3~4×106,组织不超过10mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
- 裂解液RLT Plus和去蛋白液RW1中含有盐酸胍/异硫氰酸胍化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
- 预防RNase污染,应注意以下几方面:
- 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。
- 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
- RNA在裂解液RLT Plus中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。
- 配制溶液应使用无RNase的水。
- 将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%(v/v),37℃放置过夜,高压灭菌。
- 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。
- 关于DNA的微量残留:
一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留(DNase消化也无法做到100%无残留),本试剂盒采取了百奥莱博独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术,绝大多数DNA已经被清除,不需要DNase消化,可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时应注意以下几方面。- 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
- 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
- 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理以提高效果。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁,请联系百奥莱博公司索取具体操作说明书。
- 在步骤去蛋白液RW1漂洗前,直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系百奥莱博公司索取具体操作说明书(微量DNA柱式吸附清除试剂盒)。
- 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
- RNA纯度及浓度检测:
- 完整性: RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150V,15分钟)检测完整性。由于细胞中70%~80%的RNA为rRNA,电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为2kb和1kb,分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5~2.0倍,否则提示RNA样品的降解。出现小的弥散片状或条带消失表明样品严重降解。但是应该注意区分是提取出来的RNA样品本身降解了,还是提取出来的RNA是完好的,只是在电泳过程中降解的。
- 纯度:OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA,OD260/OD280读数在2.1~2.2之间100%纯的RNA比值一般是2.2左右。
- 100%纯的RNA比值一般是2.2左右,很多公司的产品因为残留蛋白或者DNA较多,造成比值降低,无法达到2.2这个纯度标准,因此降低要求1.9~2.0就凑合使用了,但本试剂盒标准一般可以达到高水准的2.1~2.2的纯度标准。
- OD260/OD280读数受测量使用的机器影响,也受测定所用稀释溶液的pH值影响。微量分光光度计一般不需要稀释,不受稀释溶液的PH值影响。但是同一个RNA样品,如果测量的时候机器要求稀释后测量,假定在10mM Tris(pH7.5)稀释溶液中测出的OD260/OD280读数1.9~2.1之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5~1.9之间,但这并不表示RNA不纯。
- 100%纯的RNA比值一般是2.2左右,很多公司的产品因为残留蛋白或者DNA较多,造成比值降低,无法达到2.2这个纯度标准,因此降低要求1.9~2.0就凑合使用了,但本试剂盒标准一般可以达到高水准的2.1~2.2的纯度标准。
- 浓度:取一定量的RNA提取物,用RNase-free水稀释n倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260、OD280测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/μL)= (OD260)×(稀释倍数n)×40。
- 完整性: RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150V,15分钟)检测完整性。由于细胞中70%~80%的RNA为rRNA,电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为2kb和1kb,分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5~2.0倍,否则提示RNA样品的降解。出现小的弥散片状或条带消失表明样品严重降解。但是应该注意区分是提取出来的RNA样品本身降解了,还是提取出来的RNA是完好的,只是在电泳过程中降解的。
第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!
- 培养细胞
- 贴壁细胞:不需消化,彻底吸干净培养液后直接加裂解液RLT Plus(见附录一)反复吹打细胞裂解,接步骤1.e。
- 不方便直接裂解的培养容器,可用刮下细胞,或胰蛋白酶消化后吹打下来收集细胞到1.5mL离心管,接步骤1.c。
- 悬浮细胞:收集<107悬浮细胞到一个1.5mL离心管。
- 13000rpm离心10秒(或者300g离心5分钟),使细胞沉淀下来。完全吸弃上清,留下细胞团,注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
- 轻弹离心管底部,使细胞沉淀松散,加350μL(<5×106细胞)或600μL(5×106~1×107细胞)裂解液RLT Plus,用移液器反复吹打充分裂解(直到看不细胞团为止)。
- 将裂解混合物全部加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。
- 立刻接操作步骤项下3。
- 贴壁细胞:不需消化,彻底吸干净培养液后直接加裂解液RLT Plus(见附录一)反复吹打细胞裂解,接步骤1.e。
- 动物组织(例如鼠肝脑)
- 匀浆器匀浆:新鲜组织加入350μL(<20mg组织)或者600μL(20~30mg组织)的裂解液RLT Plus后玻璃匀浆器或电动匀浆器将组织彻底研磨匀浆。
- 液氮研磨+匀浆:在液氮中研磨组织成细粉后,取适量组织细粉(20mg/30mg)转入装有350μL/600μL组织裂解液RLT Plus的1.5mL离心管中,剧烈振荡20秒,难裂解样品可用移液器反复吹打匀浆。
- 若研磨匀浆后不溶物碎片太多,可将匀浆后裂解物13,000rpm离心3分钟沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物。将上清液加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。
- 将研磨均匀的匀浆液全部加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。
- 立刻接操作步骤项下3。
- 匀浆器匀浆:新鲜组织加入350μL(<20mg组织)或者600μL(20~30mg组织)的裂解液RLT Plus后玻璃匀浆器或电动匀浆器将组织彻底研磨匀浆。
- 立刻13000rpm离心1分钟,保留滤过液(RNA在滤过液中)。
- 确保离心后液体全部滤过去,膜上没有残留,如有必要,可以加大离心力和离心时间。
- 较精确估计滤过液体积(通常为350μL/600μL,滤过时候损失体积应该减去,可用移液器吸取滤液估计体积),加入等体积的70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。
- 立刻将混合物(每次小于720μL,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中(吸附柱放入收集管中),13000rpm离心30秒,弃掉废液。
- 加700μL去蛋白液RW1,室温放置30秒,13,000rpm离心30秒,弃掉废液。
- 加入500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),13000rpm离心30秒,弃掉废液。加入500μL漂洗液RW,重复一遍。
- 将吸附柱RA放回空收集管中,13000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
- 取出吸附柱RA,放入一个干净1.5mL离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30~50μL RNase-free water,室温放置1分钟,13000rpm离心1分钟得到RNA溶液。
- 洗脱缓冲液体积不应少于30μL,体积过小影响回收效率。如果需要得到更大浓度的RNA,将离心得到的RNA溶液加回到吸附柱重复洗脱一遍。
附录一:贴壁培养细胞数量表
培养器皿 | 底面积(cm2) | 加培养液量(mL) | 可获细胞量 |
24孔培养板 | 2 | 1.0 | 5×105 |
6孔培养板 | 9.6 | 2.5 | 2.5×106 |
3.5cm培养皿 | 8 | 3.0 | 2.0×106 |
6cm培养皿 | 21 | 5.0 | 5.2×106 |
25cm塑料培养瓶 | 25 | 5.0 | 5.2×106 |
100mL玻璃培养瓶 | 33 | 10.0 | 7×106 |
- 一般情况下,3.5cm直径培养皿或者更小培养容器加350μL裂解液RLT Plus,6cm直径培养皿或者更大培养容器加600μL裂解液RLT Plus。最大处理量不超过107个细胞。
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