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本试剂盒提供了一种简单、方便的从哺乳动物培养细胞或新鲜的哺乳动物组织中提取胞浆蛋白和胞核蛋白的方法。提取得到的蛋白为活性蛋白，可以用于后续操作。本试剂盒是通过在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白提取试剂提取得到细胞核蛋白。

• 兼容性好，获得的样本适合于多种下游应用，包括免疫印迹、凝胶迁移分析、蛋白分析、报告基因分析以及酶活性分析。
  
• 可在90分钟内完成蛋白的提取。
  
• 操作简单，无需超速梯度离心。
  
• 一般情况下，胞浆蛋白与核蛋白之间的交叉污染在10%左右，基因组DNA/mRNA的干扰均降到了最低。
  
• 胞核蛋白一旦经过脱盐或稀释，即可用于免疫分析和蛋白相互作用实验，如迁移率分析(EMSA)、免疫共沉淀(Co-IP)和pull-down实验。

• 抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。
  
• 对于组织样品，本试剂盒比较适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果不是很理想。
  
• 建议使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度。
  
• 如果需要更浓缩的核提取物，提取中使用的胞核蛋白提取试剂的体积可以降低2到4倍，而不会对蛋白质回收产生不利影响。
  
• 如果在随后的应用中需要大量的核提取物，或者如果下游实验出现问题，请在使用前透析核提取物以去除多余的盐。
  
• 使用蛋白酶抑制剂来保持提取物的完整性和功能。

• 细胞样品：
  
  • 对于贴壁细胞:细胞刮刮下细胞，600g离心5分钟，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
    
  • 对于悬浮细胞：600g离心5分钟，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
    
  • 加入适量的预冷的PBS重悬细胞，600g离心5分钟，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
    
  • 按照下表加入各试剂的量：
    

    细胞湿体积(μl)	胞浆蛋白提取试剂A(μl)	胞浆蛋白提取试剂B(μl)	胞核蛋白提取试剂(μl)
    10	100	5	50
    20	200	10	100
    50	500	25.5	250
    100	1000	50	500

  • 加入胞浆蛋白提取试剂A，振荡混匀数秒，使细胞完全悬浮并分散开，放置在冰上孵育10～15分钟。
    
  • 加入胞浆蛋白提取试剂B，振荡混匀5秒，冰上孵育1分钟。(注意：若胞核蛋白中掺杂胞浆蛋白，可适当延长此步骤的孵育时间，一般可以延长1～5分钟)
    
  • 振荡混匀5秒，16000g离心5分钟。
    
  • 立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白，上清至于冰上保存用与后续实验或与-80℃保存，用于后续的分析。
    
  • 加入胞核蛋白提取试剂，振荡混匀数秒，使沉淀完全悬浮并分散开，放回冰浴中孵育40分钟，期间每隔10分钟拿出来振荡混匀15秒，16000g离心5分钟。
    
  • 立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为抽提得到的细胞核蛋白，将分离的胞核蛋白溶液至于冰上保存用与后续实验或与-80℃保存，用于后续的分析。
• 组织样品：
  
  • 手术切除组织块，迅速置于预冷的PBS中，漂洗数次，滤纸吸干水分，将组织切成细小
    的组织块，称重取组织，按照下表加入各试剂的量：
    

    组织重量(mg)	胞浆蛋白提取试剂A(μl)	胞浆蛋白提取试剂B(μl)	胞核蛋白提取试剂(μl)
    20	200	10	100
    40	400	20	200
    80	800	40	400
    100	1000	50	500

  • 加入胞浆蛋白提取试剂A，在匀浆器中匀浆，在冰上操作，直至获得均匀的悬浮液，匀浆后把匀浆液转移到预冷的离心管内，冰浴放置10～15分钟。
    
  • 加入胞浆蛋白提取试剂B，振荡混匀5秒，冰上孵育1分钟。
    
  • 振荡混匀5秒，16000g离心5分钟。
    
  • 立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白，上清至于冰上保存用与后续实验或与-80℃保存，用于后续的分析。
    
  • 加入胞核蛋白提取试剂，振荡混匀数秒，使沉淀完全悬浮并分散开，放回冰浴中孵育40分钟，期间每隔10分钟拿出来振荡混匀15秒，16000g离心5分钟。
    
  • 立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为抽提得到的细胞核蛋白，将分离的胞核蛋白溶液至于冰上保存用与后续实验或与-80℃保存，用于后续的分析。
• 对于某些组织，若胞浆胞核蛋白提取不理想，可以按照如下操作来进行：
  
  • 按照20:1的比例混合胞浆蛋白提取试剂A和B(例如200μL胞浆蛋白提取试剂A中加入10μL胞浆蛋白提取试剂B)，此为组织匀浆液，
    
  • 按照1:10比例混合组织和组织匀浆液(如：20mg的组织样品，需加入200μL组织匀浆液)，并在玻璃匀浆器内充分匀浆，匀浆需在冰浴或4℃进行。
    
  • 匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟，4℃ 1500g离心5分钟。
    
  • 把上清转移至一预冷的塑料管中，此为提取得到的部分胞浆蛋白。
    注：吸上清时千万不要触及沉淀，沉淀中还有很多细胞还没有破碎。
    
  • 接下去按照细胞样品的操作步骤A.4开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，按照步骤Ａ.4～10抽提得到胞浆蛋白和胞核蛋白，两次分离得到的胞浆蛋白可以合并。