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本制品是一种简便、快速、高效的用于抗体纯化、免疫沉淀(IP)或免疫共沉淀(Co-IP)的即用型预装柱，也称层析柱或纯化柱。本制品也可用于实验中抗原抗体复合物的分离纯化。

本制品为即用型预装柱，经过一步亲和层析，即可从样品中得到高纯度的抗体，应用广泛，适合于培养液、血清、腹水或杂交瘤细胞培养上清中的IgG的纯化，或含Fc片段的重组蛋白的纯化。Protein A Agarose适合于免疫沉淀human IgG1、IgG2、IgG4，mouse IgG2a、IgG2b及rabbit IgG等。

使用本制品对结合的抗体或抗体复合物进行洗脱时，会有微量Protein A脱落，洗脱后的样品不适合用于Western等需要二抗的检测，但适合用于抗原蛋白复合物的质谱分析等不需要使用二抗的检测。

Protein A是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白，分子量为42kDa；Protein G是C型或G型链球菌表达的免疫球蛋白结合蛋白。Protein A和Protein G功能相似，能特异性地与哺乳动物免疫球蛋白结合，结合的部位通常为免疫球蛋白的Fc区，但有资料显示Protein A也会和人VH3家族的Fab区结合，而Protein G有时与Fab区也有一定结合。同时，两者对于不同的免疫球蛋白亚类的结合能力有所不同。适当重组改造的Protein A、G与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，可用于免疫沉淀或抗体的纯化。

• 本预装柱中使用的Protein A为重组蛋白，特异性强。本制品中的重组Protein A可与多数哺乳动物IgG的Fc端特异性结合，分子量为34.8kDa。该重组Protein A通过改造，仅保留了与IgG Fc端结合相关的氨基酸序列，去除了结合位点以外可能导致非特异性结合的序列，从而可以有效减少非特异性结合。每个Protein A分子可以结合5个IgG分子。
  
• 本预装柱中的琼脂糖物理化学稳定，有相对较高的线性流速。本制品中的Protein A共价连接到4%的高交联度、高流速琼脂糖上。每毫升 Protein A agarose beads (沉淀物)中共偶联有约4mg的重组Protein A。每毫升 Protein A agarose beads (沉淀物)可以结合约30～50mg human IgG。本制品中agarose beads的平均直径为90μm，蛋白纯化时的推荐线性流速为50～400cm/h，耐压指数为8kPa。
  
• 本预装柱具有标准接口，使用方便。本类型的预装柱为高纯度聚丙烯柱体，低吸附，规格有1mL和5mL两种，鲁尔接口，可适配商品化的各类中压液相纯化系统，如ÄKTA系统(也被称为AKTA系统)等；如果使用注射器或蠕动泵，需要相应的接头进行连接，否则容易出现预装柱内部压力过高而导致推不动甚至漏液的情况，如果没有相应的接头，不推荐连接注射器或蠕动泵使用。
  
• 本预装柱可重复次数多。本预装柱再生后，重复使用3～5次几乎不影响其结合能力。

• 包装中的下堵头请保存好，用于预装柱再生后的密封。
  
• 从蛋白样品收集开始，所有步骤中蛋白样品都必须在4℃或冰上操作。
  
• 请按照IgG最大结合量的80%以内准备样品，抗体纯化效果更佳。一般血清的总IgG含量在10～15mg/mL。细胞培养上清中的抗体浓度与杂交瘤克隆密切相关，胎牛血清(FBS)中的抗体也同时会被纯化。
  
• 无论是首次使用预装柱，还是再生后使用，都需要严格按照使用说明充分平衡预装柱。平衡不充分会严重影响预装柱的蛋白结合量。

• Binding buffer (结合缓冲液)：PBS pH7.4，推荐使用PBS溶液(货号：YTB1103)
  
• Elution buffer (洗脱液)：100mM glycine(pH2～3)
  
• Neutralization buffer (中和缓冲液)：推荐使用1M Tris-HCl(货号：YTB3590)
  
• Storage solution (凝胶保存液)：20%乙醇

• 用0.45微米或0.2微米孔径的滤膜过滤所用的溶液。
  
• 所有的溶液必须用超声等方法脱气(degas)。
  
• 将预装柱和所有溶液平衡至室温。

• 抗体纯化
  
  • 稀释：为确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，上柱之前先用Binding buffer至少按1:1比例稀释血清、腹水或细胞培养液样品；也可将样品装入截留分子量为3.5kDa的透析袋中，于4℃冰箱中用Binding buffer透析过夜。
    
    • 血浆样品在稀释过程中有可能由于血浆中的脂蛋白沉淀而浑浊，只需10000g离心20分钟取上清即可。
  • 平衡：安装好预装柱，打开预装柱上面的帽子(上堵口)，连接纯化系统的Binding buffer，折断或剪断下口，用10倍柱体积的Binding buffer洗涤并平衡预装柱。对于规格为1mL的预装柱，流速可以控制为1mL/min；对于规格为5mL的预装柱，流速可以控制为5mL/min。使预装柱中的琼脂糖凝胶处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。在洗涤和平衡过程中勿使预装柱滴干。
    
  • 上样：混匀稀释的样品，避免产生气泡。把样品从预装柱的上端加入，建议流速为1mL/min (1mL预装柱)或5mL/min (5mL预装柱)，这样能保证目的蛋白与琼脂糖凝胶充分接触，提高目的蛋白的回收率。同时收集穿流液，待检测。为了获得更好的抗体结合效果可将穿流液再上样，重复2遍(或将样品1次性加入层析柱后置于摇床上，轻轻摇动，结合30min)。
    
    • 如果样品的粘度比较大，即使上样体积比较少，也会造成预装柱有很大的反压，所以如果样品粘度大，需要适当稀释。同时，上样量勿超过柱子的最大结合能力，一般不超过80%为宜，而且大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器较难使用。
  • 洗涤：样品结合后，用20倍柱体积的Binding buffer洗涤预装柱以去除非特异性吸附的杂蛋白，建议流速为1mL/min，收集洗涤液。洗涤过程中勿让预装柱滴干。洗涤是否完全可以通过测定收集的洗涤液的280nm吸光度，最后的洗涤液的吸光度应该和Binding Buffer的吸光度或通过色谱系统测定紫外吸收达到一个稳定的基线而确定。
    
  • 洗脱和中和：按每毫升 洗脱液加入100μL Neutralization buffer的比例，在收集管中预先加入适量Neutralization buffer。在上一步洗涤完后，通常按5倍柱体积的Elution buffer洗脱结合的抗体。收集洗脱液，每管0.5mL～1mL。
    
  • 分管收集洗脱下的抗体，根据蛋白浓度、SDS-PAGE电泳或后续的检测效果确定洗脱峰在哪几个收集管中。
    
  • 根据使用目的保存样品或将收集的蛋白透析到其目的储存液中。
• 预装柱的再生
  
  • 用5倍柱体积的Regeneration Buffer (100mM glycine,pH2.0)洗涤预装柱。
    
  • 用5倍柱体积去离子水清洗预装柱。
    
  • 用5倍柱体积的Storage solution平衡预装柱，最后保存在等体积的Storage solution中，下堵口旋紧后4℃保存。
• 纯化样品的检测
  将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、穿流液、洗涤液及洗脱液)用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。