产品货号:
YTB4350
中文名称:
蛋白A+G琼脂糖纯化柱(1ml)
英文名称:
Protein A+G Agarose Prepacked Column, Fast Flow
产品规格:
1个
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本制品是一种简便、快速、高效的用于抗体纯化、免疫沉淀(IP)或免疫共沉淀(Co-IP)的即用型预装柱,也称层析柱或纯化柱。本制品也可用于实验中抗原抗体复合物的分离纯化。
本制品为即用型预装柱,经过一步亲和层析,即可从样品中得到高纯度的抗体,应用广泛,适合于培养液、血清、腹水或杂交瘤细胞培养上清中的IgG的纯化,或含Fc片段的重组蛋白的纯化。Protein A+G Agarose适合于免疫沉淀所有Protein A Agarose和Protein G Agarose单独可以免疫沉淀的抗体,包括human IgG1、IgG2、IgG3、IgG4,mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3,rat IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c,rabbit IgG,rabbit、goat多克隆抗体。
使用本制品对结合的抗体或抗体复合物进行洗脱时,会有微量Protein A+G脱落,洗脱后的样品不适合用于Western等需要二抗的检测,但适合用于抗原蛋白复合物的质谱分析等不需要使用二抗的检测。
Protein A是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白,分子量为42kDa;Protein G是C型或G型链球菌表达的免疫球蛋白结合蛋白。Protein A和Protein G功能相似,能特异性地与哺乳动物免疫球蛋白结合,结合的部位通常为免疫球蛋白的Fc区,但有资料显示Protein A也会和人VH3家族的Fab区结合,而Protein G有时与Fab区也有一定结合。同时,两者对于不同的免疫球蛋白亚类的结合能力有所不同。适当重组改造的Protein A、G与琼脂糖凝胶以一定的方式结合,可用于免疫沉淀或抗体的纯化。
- 本预装柱中使用的Protein A和Protein G为重组蛋白,特异性强。本制品中的重组Protein A和Protein G可与多数哺乳动物IgG的Fc端特异性结合,分子量分别为34.8kDa和22.5KDa。该重组Protein A和Protein G通过改造,仅保留了与IgG Fc端结合相关的氨基酸序列,去除了结合位点以外可能导致非特异性结合的序列,从而可以有效减少非特异性结合。每个Protein A分子和Protein G分子可分别结合5个和2个IgG分子。
- 本预装柱中的琼脂糖物理化学稳定,有相对较高的线性流速。本制品中的Protein A和Protein G共价连接到4%的高交联度、高流速琼脂糖上,并按1:1比例混合。每毫升 Protein A+G agarose beads (沉淀物)中共偶联有约4mg的重组Protein A和Protein G。每毫升 Protein A+G agarose beads (沉淀物)可以结合约18~50mg human IgG。本制品中agarose beads的平均直径为90μm,蛋白纯化时的推荐线性流速为50~400cm/h,耐压指数为8kPa。
- 本预装柱具有标准接口,使用方便。本类型的预装柱为高纯度聚丙烯柱体,低吸附,规格有1mL和5mL两种,鲁尔接口,可适配商品化的各类中压液相纯化系统,如ÄKTA系统(也称AKTA系统)等;如果使用注射器或蠕动泵,需要相应的接头进行连接,否则容易出现预装柱内部压力过高而导致推不动甚至漏液的情况,如果没有相应的接头,不推荐连接注射器或蠕动泵使用。
- 本预装柱可重复次数多。本预装柱再生后,重复使用3~5次几乎不影响其结合能力。
本类型的预装柱有1mL和5mL两种,相应的体积为Protein A+G Agarose在预装柱中压实后的体积,并保存在20%乙醇溶液中。
组分 | 规格 |
蛋白A+G琼脂糖纯化柱(1mL) | 1个 |
说明书 | 1份 |
保存:4℃,切勿冷冻,有效期1年。
- 包装中的下堵头请保存好,用于预装柱再生后的密封。
- 从蛋白样品收集开始,所有步骤中蛋白样品都必须在4℃或冰上操作。
- 请按照IgG最大结合量的80%以内准备样品,抗体纯化效果更佳。一般血清的总IgG含量在10~15mg/mL。细胞培养上清中的抗体浓度与杂交瘤克隆密切相关,胎牛血清(FBS)中的抗体也同时会被纯化。
- 无论是首次使用预装柱,还是再生后使用,都需要严格按照使用说明充分平衡预装柱。平衡不充分会严重影响预装柱的蛋白结合量。
- 需要用户自己准备的试剂
- Binding buffer (结合缓冲液):PBS pH7.4,推荐使用PBS溶液(货号:YTB1103)
- Elution buffer (洗脱液):100mM glycine(pH2~3)
- Neutralization buffer (中和缓冲液):推荐使用1M Tris-HCl(货号:YTB3590)
- Storage solution (凝胶保存液):20%乙醇
- Binding buffer (结合缓冲液):PBS pH7.4,推荐使用PBS溶液(货号:YTB1103)
- 准备工作
- 用0.45微米或0.2微米孔径的滤膜过滤所用的溶液。
- 所有的溶液必须用超声等方法脱气(degas)。
- 将预装柱和所有溶液平衡至室温。
- 用0.45微米或0.2微米孔径的滤膜过滤所用的溶液。
- 抗体纯化
- 稀释:为确保样品溶液有合适的离子强度和pH值,上柱之前先用Binding buffer至少按1:1比例稀释血清、腹水或细胞培养液样品;也可将样品装入截留分子量为3.5kDa的透析袋中,于4℃冰箱中用Binding buffer透析过夜。
- 血浆样品在稀释过程中有可能由于血浆中的脂蛋白沉淀而浑浊,只需10000g离心20分钟取上清即可。
- 平衡:安装好预装柱,打开预装柱上面的帽子(上堵口),连接纯化系统的Binding buffer,折断或剪断下口,用10倍柱体积的Binding buffer洗涤并平衡预装柱。对于规格为1mL的预装柱,流速可以控制为1mL/min;对于规格为5mL的预装柱,流速可以控制为5mL/min。使预装柱中的琼脂糖凝胶处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋白的作用。在洗涤和平衡过程中勿使预装柱滴干。
- 上样:混匀稀释的样品,避免产生气泡。把样品从预装柱的上端加入,建议流速为1mL/min (1mL预装柱)或5mL/min (5mL预装柱),这样能保证目的蛋白与琼脂糖凝胶充分接触,提高目的蛋白的回收率。同时收集穿流液,待检测。为了获得更好的抗体结合效果可将穿流液再上样,重复2遍(或将样品1次性加入层析柱后置于摇床上,轻轻摇动,结合30min)。
- 如果样品的粘度比较大,即使上样体积比较少,也会造成预装柱有很大的反压,所以如果样品粘度大,需要适当稀释。同时,上样量勿超过柱子的最大结合能力,一般不超过80%为宜,而且大量的样品体积也可能造成很大的反压,使得进样器较难使用。
- 洗涤:样品结合后,用20倍柱体积的Binding buffer洗涤预装柱以去除非特异性吸附的杂蛋白,建议流速为1mL/min,收集洗涤液。洗涤过程中勿让预装柱滴干。洗涤是否完全可以通过测定收集的洗涤液的280nm吸光度,最后的洗涤液的吸光度应该和Binding Buffer的吸光度或通过色谱系统测定紫外吸收达到一个稳定的基线而确定。
- 洗脱和中和:按每毫升 洗脱液加入100μL Neutralization buffer的比例,在收集管中预先加入适量Neutralization buffer。在上一步洗涤完后,通常按5倍柱体积的Elution buffer洗脱结合的抗体。收集洗脱液,每管0.5mL~1mL。
- 分管收集洗脱下的抗体,根据蛋白浓度、SDS-PAGE电泳或后续的检测效果确定洗脱峰在哪几个收集管中。
- 根据使用目的保存样品或将收集的蛋白透析到其目的储存液中。
- 稀释:为确保样品溶液有合适的离子强度和pH值,上柱之前先用Binding buffer至少按1:1比例稀释血清、腹水或细胞培养液样品;也可将样品装入截留分子量为3.5kDa的透析袋中,于4℃冰箱中用Binding buffer透析过夜。
- 预装柱的再生
- 用5倍柱体积的Regeneration Buffer (100mM glycine,pH2.0)洗涤预装柱。
- 用5倍柱体积去离子水清洗预装柱。
- 用5倍柱体积的Storage solution平衡预装柱,最后保存在等体积的Storage solution中,下堵口旋紧后4℃保存。
- 用5倍柱体积的Regeneration Buffer (100mM glycine,pH2.0)洗涤预装柱。
- 纯化样品的检测
将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、穿流液、洗涤液及洗脱液)用SDS-PAGE进行检测,判定其纯化效果。
问题 | 可能原因 | 推荐解决方法 |
预装柱流速过慢(如<0.5mL/min) | 样品注射时产生气泡或过柱溶液中有气泡,导致填料孔被微小气泡堵塞 | 样品注射时严格遵守操作规程以避免气泡产生;对过柱溶液进行脱气处理 |
没有纯化得到目标抗体或纯化量很少 | 样品中抗体浓度太低 | 使用抗原偶联的介质进行目标抗体的纯化;更换培养条件,如使用无血清培养基等 |
没有纯化得到目标抗体或纯化量很少 | 选择的预装柱种类不正确 | 根据抗体的免疫球蛋白亚类选择合适的预装柱产品 |
目标抗体虽被纯化但发生明显的降解 | 抗体对低pH的Elution buffer或Neutralization buffer较为敏感 | 在蛋白收集管中预先加入Neutralization buffer,然后再进行抗体的洗脱和收集;抗体收集好后即时进行脱盐或将其透析到合适的缓冲液中 |
纯化量逐渐减低 | 上样量太大;柱子太脏,载量降低 | 减少上样量;清洗和再生预装柱 |
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