抗Flag标签亲和凝胶

产品货号：

YTB4336

中文名称：

抗Flag标签亲和凝胶

英文名称：

Anti-Flag Agarose Gel

产品规格：

0.5mL|2mL|10mL

发货周期：

1～3天

产品价格：

询价

本产品由高质量的单克隆鼠源Flag抗体与琼脂糖共价偶联而成，可与常规蛋白表达系统(如哺乳动物细胞、细菌或酵母)中含有Flag标签的蛋白特异性地结合，从而用于带有Flag标签的融合蛋白或蛋白复合物的免疫沉淀(IP)或纯化。

本产品为50%凝胶悬液，包装体积为总体积，每mL本产品中共含有0.5mL纯凝胶(沉淀物)。

背景资料

Flag-tag是8个氨基酸残基(DYKDDDDK)组成的多肽，常用的形式有Flag和3X Flag，通过基因重组技术把Flag-tag的核酸序列与目的基因的5’端或3’端连接，就可以最终表达形成Flag-tag的目的蛋白。Flag-tag具有以下优点：Flag-tag通常不会与目的蛋白相互作用，并且大多数情况下不会影响目的蛋白的功能；Flag-tag作为标签蛋白，后续通过Flag抗体(YT773)、Anti-Flag磁珠(YTB4316)或Anti-Flag亲和凝胶(YTB4326/YTB4336)即可对目的基因的表达、定位及功能进行检测或对目的蛋白进行纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等；融合在N端的Flag标签，可被肠激酶(Enterokinase,EK)切除(DDDK)，从而得到完美的没有标签的目的蛋白。基于以上优点，Flag标签已被广泛应用于蛋白表达、纯化、鉴定、相互作用和功能等多方面的研究。

产品特点

本产品有较高的融合蛋白结合量、特异性强：
每ml纯凝胶(settled gel)含有约8mg Flag抗体，可结合约1mg融合蛋白，且特异性强，非特异的杂蛋白结合少。
本产品可结合多种形式的Flag标签蛋白：
本产品可特异性地结合甲硫氨酸修饰的N端Flag融合蛋白(Met-Flag-Protein)、N端Flag融合蛋白(Flag-Protein)、C端Flag融合蛋白(Protein-Flag)或中间带有Flag的融合蛋白。
本产品可选择多种洗脱方法：
本产品根据蛋白结构的完整性、生物功能及后续应用的要求等，可使用多种洗脱方法，包括Flag多肽、酸性和SDS-PAGE上样缓冲液等洗脱液进行洗脱。特别是Flag多肽洗脱后不包含抗体的轻链和重链，可以有效解决免疫沉淀后Western实验中轻链和重链的干扰问题。
本产品可重复使用多次，性价比高：
在正常情况下，本产品用于相同蛋白的纯化时可回收使用3～5次。如果用于免疫共沉淀检测蛋白-蛋白的相互作用，不推荐重复使用。

货号	YTB4336	YTB4326
浓度	50%	50%
储存液	50%甘油，10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)，含保护剂	TBS(pH7.6)，含保护剂
基质	4%琼脂糖	4%交联琼脂糖
平均粒径	约90μm
抗体	小鼠抗Flag-tag单抗
抗体类型	IgG2b
抗体分子量	约150kDa
抗体浓度	约8mg/mL
结合能力	约1mg Flag变迁蛋白/mL
应用	IP、Co-IP、蛋白纯化

组分	0.5mL	2mL	10mL
Anti-Flag Affinity Gel	0.5mL	2mL	10mL
说明书	1份

保存：-20℃，有效期一年。

注意事项

本产品使用前一定要充分重悬，即充分颠倒若干次使混合均匀。
本产品含有微量的防腐剂，不会影响常规的蛋白或蛋白复合物的纯化和免疫沉淀。但如果后续涉及酶活性测定，使用本产品前宜先用TBS等适当溶液洗涤凝胶3次，以充分消除防腐剂可能产生的干扰。
在免疫沉淀或纯化时，建议设计阳性和阴性对照组。
蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，可以在蛋白样品中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，例如百奥莱博的通用型蛋白酶抑制剂混合物(货号：YT964)、通用型蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(质谱兼容，货号YTB4017)、蛋白酶抑制剂混合物(哺乳动物样品专用，货号YT966)、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(哺乳动物样品专用，货号YTB4018)等，或细菌蛋白酶抑制剂混合物(货号：YT969)。
高浓度的DTT、巯基乙醇、盐酸胍等对本产品与标签蛋白的结合可能有一定影响，但WB及IP细胞裂解液(货号：YT038)、RIPA裂解液(货号：YT609、YT610、YT611)或NP-40裂解液(货号：YT613)等都完全适用。
若离心不能完全除去蛋白样品中的不溶物，可以将样品溶液用0.45μm的滤膜过滤。

样品的制备
- 选择合适的裂解液，用于制备细胞或组织的裂解液。优先推荐选择百奥莱博的WB及IP细胞裂解液(货号：YT038)用于细胞或组织样品的裂解。根据特定的实验目的，如有必要，也可以使用百奥莱博的RIPA裂解液(强，货号YT609)、RIPA裂解液(中，货号YT610)或RIPA裂解液(弱，货号YT611)用于样品的制备。如果使用自行配制的或其它公司生产的裂解液，需要确保裂解液的pH为6～8。
- 具体的细胞或组织样品裂解的制备步骤请参考裂解液的使用说明。制备好的裂解液上清宜置于冰上或4℃存放，随后即可用于免疫沉淀或免疫共沉淀、标签蛋白的纯化等操作。新鲜制备好的样品，建议尽量当天完成免疫沉淀等后续操作，但如果样品不能当天使用，也可以适当分装后-80℃冻存。
Anti-Flag Affinity Gel的准备
由于Anti-Flag Affinity Gel储存在含50%甘油的保护液中，所以需要在加入样品前适当洗涤。
- 轻轻重悬Anti-Flag Affinity Gel，尽量形成均匀的凝胶悬液，按照通常每100μL细胞裂解液中加入20μL混合均匀的凝胶悬液(以下免疫沉淀法中都以20μL凝胶悬液为例)，取适量Anti-Flag Affinity Gel至一洁净离心管中(货号：YTB8001)，加入1×TBS(货号：YTB1280、YTB1282)至最终体积为约0.5mL。
  注：使用大孔径吸头(如用剪刀剪去部分吸头)吸取凝胶悬液会比较方便。
- 轻轻重悬Anti-Flag Affinity Gel，6000×g在4℃离心30秒，小心去除上清，不要吸到凝胶。重复上述步骤两次。
- 按照初始体积的量，用1×TBS重悬Anti-Flag Affinity Gel。
免疫沉淀(IP)
- 加入凝胶与孵育：按照每100μL蛋白样品加入20μL凝胶悬液的比例加入Anti-Flag Affinity Gel，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，4℃孵育1～2小时。如需提高结合效率，可4℃孵育过夜。
- 离心分离：孵育完毕后，6000×g在4℃离心30秒，小心去除上清，不要吸到凝胶。
  注：可保留部分上清液，用于检测免疫沉淀的效果。
- 洗涤：加入500μL的1×TBS，轻轻重悬Anti-Flag Affinity Gel，冰浴并置于摇床上5分钟，然后6000×g在4℃离心30秒，小心去除上清，不要吸到凝胶。重复洗涤三次。样品置于冰上用于洗脱。
洗脱
根据标签蛋白的特点及后续实验要求，可以选择如下3种方法之一进行洗脱。
- 3X Flag竞争洗脱法：
  本方法为非变性法，洗脱效率高，且洗脱后的蛋白保持原有的生物活性，便于后续分析检测。
  - 3X Flag多肽洗脱液的配制：取适量3X Flag多肽(YTB1290)溶解于1×TBS中，使其终浓度为150μg/ml，或稀释5mg/ml的3X Flag多肽溶液(YTB1290)至150μg/ml。
  - 每20μL原始凝胶悬液体积，加入100μL 3X Flag多肽洗脱液(150μg/ml)，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温摇晃孵育30～60分钟，或4℃孵育1～2小时。为了提高洗脱效率，可延长孵育时间或重复洗脱。3X Flag多肽洗脱液体积一般为凝胶悬液的5倍。
  - 孵育完毕后，6000×g在4℃离心30秒，将上清转移到新的离心管中。上清即为洗脱的Flag标签蛋白。
  - 洗脱的Flag标签蛋白置于4℃待用，或者-20℃或-80℃长期保存。
- 酸性洗脱法：
  本方法为非变性法，比较快速且高效。洗脱后的蛋白保持原有的生物活性，便于后续分析检测。
  - 溶液的配制：酸性洗脱液(0.1M Glycine-HCl,pH3.0)，中和液(0.5M Tris-HCl,pH7.4,1.5M NaCl)。
  - 每20μL原始凝胶悬液体积，加入100μL酸性洗脱液，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育5分钟。酸性洗脱液体积一般为凝胶悬液的5倍。
    注：孵育时间不宜超过15分钟。
  - 孵育完毕后，6000×g在4℃离心30秒，将上清转移到新的离心管中，并立刻加入10μL中和液，适当混匀。
  - 为了获得最大的洗脱效率，可重复步骤b和c，并将相同样品合并。
  - 洗脱并中和的Flag标签蛋白置于4℃待用，或者-20℃或-80℃长期保存。
    注1：酸性洗脱法虽然高效，但仍可能低于竞争洗脱法或SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法。
    注2：由于目的蛋白的差异可能对酸性洗脱法的洗脱效率有一定的影响，如果对洗脱效率的要求比较高，可对酸性洗脱液的pH在2.5～3.1之间进行一定的调整，相应的中和液的pH值或量也要进行一定的调整，例如100μL酸性洗脱液(0.1M Glycine-HCl,pH2.8)和15μL中和液(1M Tris-HCl,pH8.5)。
- SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法：
  本方法为变性法，得到的蛋白样品适合SDS-PAGE电泳或WB检测。
  - SDS-PAGE上样缓冲液的配制：可以直接使用百奥莱博的YT051 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2X)，但含有DTT等还原剂，用该上样缓冲液洗脱得到的样品中含有Flag抗体的轻链和重链。也可以自行参考《分子克隆》等配制不含DTT的2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
  - 每20μL原始凝胶悬液体积，加入20μL 2×SDS-PAGE上样缓冲液，95℃加热5分钟。
  - 6000×g在4℃或室温离心30秒，取上清进行SDS-PAGE电泳或WB检测。
    注：由于上样缓冲液中SDS会破坏Flag抗体，所以洗脱后的凝胶不能重复使用。

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