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本试剂盒采用新型的用于磷酸化蛋白纯化的NTA-Fe琼脂糖磁珠，配合优化的缓冲液，可简单、快速、灵活、高效且高特异性地与细胞、动植物或者微生物裂解液、血清、腹水等样品中磷酸化蛋白结合，从而用于磷酸化蛋白或磷酸化蛋白复合物的纯化、免疫沉淀(IP)或免疫共沉淀(Co-IP)。

本试剂盒中的NTA-Fe琼脂糖磁珠是一种由高质量的次氮基三乙酸(NTA)共价偶联至琼脂糖磁珠，再通过NTA的4个结合位点螯合三价铁离子(Fe³⁺)制备而成的琼脂糖磁珠。本试剂盒可特异性地结合磷酸化蛋白，并可以借助磁力架等磁分离设备非常便捷地应用于磷酸化蛋白或其蛋白复合物的纯化或免疫沉淀等实验。

磷酸化蛋白是研究最多的一种蛋白质翻译后修饰，蛋白质的磷酸化和去磷酸化对生物体的众多生命活动起着至关重要的作用。质谱分析可精确鉴定蛋白质中发生的磷酸化修饰，并定位到具体的氨基酸残基，是磷酸化蛋白组学研究的核心技术。在进行质谱分析前，需要将蛋白质直接酶解成片段，但是这样的操作不仅增加了样品的复杂度，并且由于酶解后大量非磷酸化肽段抑制磷酸化肽段的质谱信号从而降低了磷酸化肽段的质谱检测灵敏度。因此，在质谱分析前对磷酸化蛋白或多肽进行有效的分离富集非常重要。本试剂盒的NTA-Fe琼脂糖磁珠能高效且快速地进行磷酸化蛋白和磷酸化多肽的富集和纯化，蛋白纯化步骤简便，纯化条件温和，且蛋白纯化后可直接进行下游实验。

本试剂盒的NTA-Fe琼脂糖磁珠是基于固定化金属离子亲和层析(IMAC)技术研发而成。研究发现，二价金属离子如铜离子、锌离子和镍离子可用于His-tag蛋白的分离纯化，而三价铁离子和四价钛离子可用于磷酸化蛋白的富集和纯化。

• 使用便捷，提供了配套试剂：本试剂盒提供了磷酸化蛋白纯化所需的相关试剂，为磷酸化蛋白的纯化带来了极大的便利。同时本试剂盒的NTA-Fe琼脂糖磁珠储存在特殊保护液中，不含甘油，配合试剂盒提供的缓冲液，可以通过磁性吸附实现快速高效的分离纯化，无需离心操作。
  
• 稳定性高、特异性强、靶蛋白结合量高：与国内外大多数的同类产品相比，本试剂盒的NTA-Fe琼脂糖磁珠铁离子配基密度较高，铁离子脱落程度低，对磷酸化蛋白的结合具有很强的特异性。本试剂盒的NTA-Fe琼脂糖磁珠每毫升悬浊液含约25%琼脂糖磁珠沉淀，含有不少于30μmol/mL的NTA-Fe3+，通常每毫升琼脂糖磁珠沉淀可结合>12mg磷酸化蛋白，具体的最大结合量和磷酸化蛋白的分子量大小等相关。
  
• 结合目的蛋白速度快：本试剂盒的NTA-Fe琼脂糖磁珠使用了NTA螯合的铁离子，粒径在100μm左右，配合优化的缓冲液，通常30分钟内即可完成磷酸化蛋白吸附的过程，60分钟内完成目的蛋白纯化或免疫沉淀操作。缩短操作时间可以有效避免在长时间操作过程中目的蛋白的降解或变性，充分保证目的蛋白的活性。
  
• 可高效洗脱磷酸化蛋白：本试剂盒根据磷酸化蛋白的结构、生物学功能及后续应用的要求等，使用磷酸盐进行多次洗脱。洗脱时间短，洗脱效率高。

本试剂盒中NTA-Fe琼脂糖磁珠每毫升悬浊液中共含约0.25mL琼脂糖磁珠沉淀。NTA-Fe琼脂糖磁珠标注的体积为悬浊液总体积。每毫升悬浊液可以用于纯化约3mg分子量约为60kD的磷酸化蛋白。磷酸化蛋白分子量的大小会影响本制品可以纯化的目的蛋白的mg数。

如果每个样品需要使用1mL或200μL裂解液，本试剂盒足够进行5次或25次磷酸化蛋白纯化。对于分子量为60kD的磷酸化蛋白，每次可纯化的磷酸化蛋白最大量为3mg或600μg。每个样品的裂解液用量可以酌情进行调节的。

• 本试剂盒纯化时不可以使用磷酸盐类缓冲液，以免和磷酸化蛋白形成竞争结合，从而降低NTA-Fe琼脂糖磁珠的磷酸化蛋白载量。
  
• 本试剂盒中的NTA-Fe琼脂糖磁珠经测试，冻融3次不影响效价，但仍建议适当分装减少冻融次数。频繁使用建议4℃保存。
  
• 本试剂盒中的NTA-Fe琼脂糖磁珠需维持pH为6～8，避免高速离心、干燥；请勿长时间将磁珠置于磁场中，否则可能会引起磁珠聚团。
  
• 本试剂盒使用过程中，缓冲试剂如Tris、HEPES、MOPS等的浓度不宜超过100mM，Triton、Tween、NP-40的浓度不宜超过2%，脱氧胆酸钠、CHAPS的浓度不宜超过1%。其它未提及试剂的兼容性可以参考上述试剂，但有待实验验证。
  
• 本试剂盒中的NTA-Fe琼脂糖磁珠使用前要适当充分重悬，即颠倒若干次使磁珠混合均匀，混匀操作须轻柔，不宜剧烈涡旋震荡。
  
• 在纯化或免疫沉淀时，建议设置阳性和阴性对照组。
  
• 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，可以在蛋白样品中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，但不要添加EDTA。例如通用型蛋白酶抑制剂混合物、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(质谱兼容)、哺乳动物样品专用蛋白酶抑制剂混合物、哺乳动物样品专用蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物等。
  
• 如果使用真空泵等仪器吸取上清液，须注意真空泵的吸液强度，以免吸力过大而吸取到聚集的磁珠。
  
• 0.1%的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可有效防止磁珠聚集，并且不会影响磁珠的抗体结合效率。
  
• 如果自行配制裂解液，需注意DTT、巯基乙醇和EDTA等对本试剂盒与磷酸化蛋白的结合可能有一定影响，但Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)或RIPA裂解液(强，无抑制剂)等都完全适用。

• 试剂盒的准备：
  
  • 参考下表，按照每个样品使用1mL裂解液的比例，准备相关试剂。如果使用不同的裂解液体积，其它试剂的用量需要按比例进行调整。
    

    步骤	所需溶液	每次实验用量
    细胞裂解与样品制备	含蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的裂解缓冲液	1mL
    NTA-Fe磁性琼脂糖磁珠制备	Binding/Wash Buffer	约3mL
    磷蛋白结合	NTA-Fe磁性琼脂糖磁珠	1mL
    洗涤(3次)	Binding/Wash Buffer	每次1mL
    洗脱	Elution Buffer	约3mL

    
    
  • 含抑制剂裂解液的配制：细胞裂解液中推荐在裂解细胞或组织样品加入通用型蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(质谱兼容)，这样可以有效避免蛋白的降解和磷酸化蛋白的去磷酸化。请勿加入EDTA。参考上表，按照每1000万细胞使用1mL含抑制剂裂解液的比例，配制适量的含抑制剂裂解液。例如将Lysis Buffer与蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(质谱兼容)中的蛋白酶抑制剂混合物(50X)、磷酸酶抑制剂混合物(50X)按照50:1的比例混合，即在1mL的Lysis Buffer中各加入20μL蛋白酶抑制剂混合物(50X)、磷酸酶抑制剂混合物(50X)，得到约1mL含抑制剂裂解液。配制好的含抑制剂裂解液宜放置在冰浴或4℃。
    
    • 含抑制剂裂解液宜现用现配，不宜配制后冻存并留作后续使用。如果有特殊需求，可以尝试百奥莱博的其它多种蛋白酶、磷酸酶和去乙酰化酶抑制剂混合物。
  • NTA-Fe琼脂糖磁珠的准备：由于磁珠储存在特殊保护液中，所以需要在加入样品前适当洗涤。
    ① 用移液器轻轻吹打重悬NTA-Fe磁珠，按照每3mg目标蛋白(分子量约为60kD)需要使用1mL磁珠悬浊液的用量，取适量NTA-Fe磁珠至一洁净离心管中，磁性分离去除上清；加入与原磁珠悬浊液等体积或适当更大体积的Binding/Wash Buffer洗涤磁珠。
    ② 用移液器轻轻吹打重悬NTA-Fe磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复上述步骤两次。
    ③ 按照初始体积的量，用Binding/Wash Buffer重悬NTA-Fe磁珠。
• 细胞或组织样品的裂解和准备。样品裂解后宜立即进行后续的磷酸化蛋白的纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等操作，如果不能立即进行后续的实验，可以-20℃或-80℃冻存，但冻融可能会影响蛋白与蛋白的相互作用。所有的样品裂解步骤宜在冰浴或4℃操作，以尽量减少蛋白降解的可能性。样品准备好后，注意取一定量作为Input或Total，以用于后续的Western等检测。
  
  • 悬浮细胞的样品裂解和准备：250～1000×g室温离心5分钟收集细胞。如有必要，可以使用生理盐水，然后吸净残留的液体。轻轻vortex或者弹击管底以把细胞尽量分散开。按照每1000万细胞加入1mL的比例加入含抑制剂裂解液。轻弹管底或适当吹打，以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，建议分装成50～100万细胞/管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。充分裂解后，10000～14000×g在4℃离心3～5分钟，取上清，即可进行后续的免磷酸化蛋白的纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等操作。
    
    • 裂解后会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。
  • 贴壁细胞样品的裂解和准备：吸除培养液。如有必要，可以使用生理盐水，然后吸净残留的液体。按照每1000万细胞(相当于一个10cm的细胞培养皿)加入1mL的含抑制剂裂解液，适当吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触动物细胞1～2秒后，细胞就会被裂解。植物细胞宜在冰上裂解2～10分钟。充分裂解后，10000～14000×g在4℃离心3～5分钟，取上清，即可进行后续的磷酸化蛋白的纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等操作。
    
    • 裂解后会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。
  • 组织样品的裂解和准备：
    
    • 把组织剪切成细小的碎片。如果组织样品本身非常细小，也可以不再进行剪切。
      
    • 按照每10～20mg组织使用100～200μL的比例加入含抑制剂裂解液。如果裂解不充分可以使用更多的含抑制剂裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
      
    • 用玻璃匀浆器匀浆，或使用组织研磨仪研磨，直至充分裂解。也可以把组织样品冷冻后液氮研磨，研磨充分后加入裂解与洗涤液进行裂解。
      
    • 充分裂解后，10000～14000×g在4℃离心3～5分钟，取上清，即可进行后续的磷酸化蛋白的纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等操作。每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200μL含抑制剂裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为15～25mg/mL，不同状态的不同组织有所不同。
      
      • 裂解后很可能会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。
• 目标蛋白与磁珠结合：
  
  • 加入磁珠与孵育：按照每3mg目标蛋白(分子量约为60kD)样品(BCA法检测蛋白浓度)，加入1mL磁珠悬浊液的比例加入NTA-Fe磁珠，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育30分钟。
    
    • 如果需要，可以在2～8℃旋转混合1小时，以防止目标蛋白降解。
  • 磁分离：孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，去除上清。
    
    • 对于上清部分，可适量保存并用于检测纯化的效果。
  • 洗涤：加入1mL的Binding/Wash Buffer，用移液器轻轻吹打重悬NTA-Fe磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复洗涤三次。
• 洗脱：
  
  • 根据目标蛋白的浓度及后续实验要求，可以加入0.2～1mL Elution Buffer，轻轻翻转离心管数次，摇床摇动洗脱5分钟，磁性分离，收集洗脱液到新的离心管，即为纯化的磷酸化蛋白。
    
  • 如果需要，重复上述步骤2～3次，收集样品到新的离心管中，还可以得到一些磷酸化蛋白。
• 磁珠的清洗和再生：
  
  • 向离心管加入1mL Elution Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠重悬，涡旋10秒，磁性分离，去除上清。重复3次。
    
  • 向离心管中加入1mL 20%乙醇，上下翻转离心管数次，使磁珠重悬，涡旋10秒，磁性分离，去除上清。重复3次。
    
  • 磁珠保存在20%乙醇中，使总体积等于初始悬浮液体积，置于4℃或-20℃保存，并可用于下一次同种蛋白的纯化。待检测的不同样品，不建议使用清洗和再生的NTA-Fe磁珠。