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BCA蛋白定量法是目前广泛使用的蛋白定量方法之一。本制品是基于BCA(Bicin-choninic Acid)法研制而成，实现了对蛋白质进行快速、稳定、灵敏的浓度测定。其原理是在碱性环境下蛋白质分子中的肽链结构能与Cu²⁺络合生成络合物，同时将Cu²⁺还原成Cu+。BCA试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色的复合物。在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来测定蛋白质的含量。本试剂盒含有牛血清白蛋白(BSA)溶液作为蛋白质标准品溶液，测定范围为20～2000μg/mL。

• 本试剂盒可以采用分光光度计(试管检测法)或者酶标仪(微孔检测法)测定蛋白浓度。
  
• 建议每次测定蛋白样品时，绘制标准曲线，以获得准确数据。
  
• BSA标准品的稀释液需与待测样品的稀释液一致(可用1×PBS或0.9%生理盐水稀释)。
  
• 如待测样品中含较多的干扰物质(具体见附表1)，可采用Bradford蛋白定量试剂盒(货号：WE0275)或其他蛋白定量产品。

• 稀释BSA标准品：用与待测蛋白样品相一致的稀释液按下表稀释BSA标准品。
  

  管号	稀释液用量(μl)	BSA标准品用量(μl)	BSA标准品最终浓度(μg/μl)
  A	0	100	2
  B	200	200	1
  C	200	200(从B管中取)	0.5
  D	200	200(从C管中取)	0.25
  E	200	200(从D管中取)	0.125
  F	200	200(从E管中取)	0.0625
  G	200	0	0(空白)

• 配置BCA工作液：
  
  • 计算BCA工作液总量：
    BCA工作液总量=(BSA标准品样本个数+未知样本个数)×复孔数×每个样本BCA工作液体积
    举例：BSA标准品样本个数为7个，未知样本个数2个，复孔数3个。
    试管检测法：
    BCA工作液总量=(7个BSA标准品样本+2个未知样本)×3个复孔×2mL/每个样本工作液体积=54mL
    微孔检测法：
    BCA工作液总量=(7个BSA标准品样本+2个未知样本)×3个复孔×200μL/每个样本工作液体积=5.4mL
    
  • 根据计算出的BCA工作液需要总量，将BCA-A和BCA-B按照50:1的体积比，配制BCA工作液，充分混匀。
    注意：
    ① 由于加样可能存在误差，建议配制BCA工作液时，多配制1～2个孔。
    ② 新配制的BCA工作液室温密封条件下可稳定保存24小时。
• 定量检测
  
  • 试管检测法(蛋白浓度检测范围：20～2000μg/mL)
    
    • 按上表，将稀释好的A-G BSA标准品和待测蛋白样品(原液或稀释液)各100μL分别加到作好标记的试管中。推荐每个测定的样本做2～3个平行反应。
      
    • 向每个试管中各加入2mL BCA工作液，充分混匀，37℃水浴中孵育30分钟，将各管冷却至室温，须在3～5分钟内完成检测。
      
    • 用分光光度计在562nm处，测定每个样品及BSA标准品的吸光值，同时做好记录。
      
    • 绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。
  • 微孔检测法(蛋白浓度检测范围：20～2000μg/mL)
    
    • 按上表，将稀释好的A-G BSA标准品和待测蛋白样品(原液或稀释液)各25μL分别加到作好标记的96孔板微孔中。推荐每个测定的样本做2～3个平行反应。
      
    • 每孔加入200μL BCA工作液，充分混匀，盖上96孔板盖，37℃孵育30分钟，冷却至室温，须在3～5分钟内完成检测。
      
    • 用酶标仪在540～590nm范围内，测定每个样品及BSA标准品的吸光值，同时做好记录。
      
    • 绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。
      注意：
      ① BCA法测定蛋白浓度时，吸光值会随着时间的延长不断加深。因此所有样品测定需在3～5分钟内完成，否则会影响蛋白定量的准确度。
      ② 建议以去除背景值后的吸光值读数绘制标准曲线。
      ③ 由于操作误差导致标准品读数严重偏离线性曲线的应舍去。
      ④ 未知样品浓度可以从标准曲线方程中计算得出，实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。
      ⑤ 如果得到的蛋白浓度不在检测范围内，请重新稀释样品后再次测定。
• BCA蛋白定量分析结果举例：
  微孔板检测法结果
  

  蛋白浓度(μg/μL)	原始吸光值	去除背景值后的吸光值	分析图
  0	0.086(背景值)	0.000
  0.125	0.123	0.037
  0.25	0.280	0.194
  0.5	0.551	0.465
  1	1.068	0.982
  2	2.000	1.913