产品货号:
WE0266
中文名称:
His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)
英文名称:
His-Tagged Protein Purification Kit(Inclusion Body Protein)
产品规格:
5ml
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒采用镍柱纯化系统,对6×His-tag蛋白具有显著特异吸附能力,能够高效一步纯化带有6个组氨酸亲和标签的蛋白。该系统具有4个Ni2+螯合位点,较只有3个螯合位点的Ni-IDA结合Ni2+更为牢固,有效防止纯化过程中Ni2+脱落且增强对His标签蛋白的结合能力,提高纯化效率。较高的基团密度,大大提高了蛋白载量。该系统在天然或变性条件下,对来源于各种表达系统(如杆状病毒,哺乳细胞,酵母以及细菌)中的His标签蛋白,均有很好的纯化效果。本制品已螯合镍离子,可直接用于包涵体蛋白的纯化,使用方便,快捷。
支持物:CL-6B琼脂糖凝胶
载量:20~30mg His标签蛋白/ml填料
粒径:50~160μM
组分 | 规格 | 保存 |
Ni-Agarose Resin | 5mL | 2~8℃,避免冷冻 |
Bacterial Protein Extraction Reagent | 65mL | 2~8℃ |
Urea | 365g | |
1M Tris-HCl(pH7.9) | 15mL | |
1M Imidazole | 65mL | |
3M NaCl | 120mL | |
吸附柱(12mL) | 1套 | |
Protease Inhibitor Cocktail | 700μL | -20℃ |
- 在纯化之前采用电泳检测蛋白的可溶性,本试剂盒只适合于包涵体蛋白的纯化,如需纯化可溶性蛋白,请选择我公司的His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)(货号:WE0267)。
- 缓冲液中不建议使用β-巯基乙醇、DTT和EDTA。
- 整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。
- 为提高纯化效率,首先确定Binding Buffer和Elution Buffer中Imidazole(咪唑)的最佳使用浓度。必要时可以使用线性或梯度浓度的Imidazole(咪唑)(10~500mM)洗脱蛋白,并通过SDS-PAGE或Western Blotting来检测目的蛋白的纯度。
- 请使用高纯度的试剂配制缓冲液,并通过0.22μm或者0.45μm过滤器过滤。为避免柱子被堵塞,建议将裂解液进行离心,或者使用0.22μm或者0.45μm过滤器过滤。
- 柱再生时,保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。
- 如果有些蛋白采用尿素的溶解效果不好,可以采用盐酸胍进行溶解。
- 缓冲液的准备
包涵体蛋白纯化缓冲液配方:成分 Tris-HCl(pH7.9) Imidazole NaCl Urea Binding Buffer 20mM 5mM 0.5M 8M Elution Buffer 20mM 500mM 0.5M 8M - 组装层析柱
- 将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱,室温静置10分钟,待凝胶与溶液分层后,把底部的出液口打开,让乙醇通过重力作用缓慢流出。。
注意:- 填料的上层是乙醇保护层,将填料和乙醇一起混匀,以每ml填料纯化20~30mg His标签蛋白计算,取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。
- 如果乙醇不流出,可以给柱子一个外力,例如用大拇指对柱口轻轻按压一下,迫使乙醇流出。
- 本实验都是通过重力作用使溶液流出。
- 填料的上层是乙醇保护层,将填料和乙醇一起混匀,以每ml填料纯化20~30mg His标签蛋白计算,取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。
- 向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后,再用8倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子,平衡结束后即可上样。
注意:柱体积指的是填料的体积。
- 将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱,室温静置10分钟,待凝胶与溶液分层后,把底部的出液口打开,让乙醇通过重力作用缓慢流出。。
- 包涵体蛋白的纯化
- 收集菌体后,每100mg菌体(湿重)加入2mL细菌裂解液(每1mL细菌裂解液中请预先加入10μL蛋白酶抑制剂混合物),如有需要可以超声裂解菌体。
注意:- 当提取物粘度高或提取蛋白为包涵体时,建议加入DNase I和Lysozyme。每1mL细菌抽提试剂中加入1μL DNase I(1000U/mL),2μL Lysozyme(50mg/mL),DNase I和Lysozyme可单独从我公司购买,溶菌酶(货号:WE0214)、RNase-Free DNase I(货号:WE0213),如使用其它公司产品,请按照相应说明书操作。
- 超声过程中保持菌液处于冰浴中,超声条件依赖于所使用的超声仪功率,探头种类,容器的大小形状,需实验中自己摸索,应避免连续超声导致的大量产热,可分成短时间,多次超声,通过一定的间隔时间避免溶液过热。最终菌液变清即可。
- 当提取物粘度高或提取蛋白为包涵体时,建议加入DNase I和Lysozyme。每1mL细菌抽提试剂中加入1μL DNase I(1000U/mL),2μL Lysozyme(50mg/mL),DNase I和Lysozyme可单独从我公司购买,溶菌酶(货号:WE0214)、RNase-Free DNase I(货号:WE0213),如使用其它公司产品,请按照相应说明书操作。
- 10000×g,4℃离心15分钟,分离上清和沉淀,并收集沉淀。
- 将沉淀重悬于Binding Buffer中,尽量混匀使包涵体充分溶解。
- 10000×g离心20分钟,收集上清。
注意:建议将离心后的上清以孔径为0.22μM或者0.45μM的滤膜过滤。 - 将上清负载上柱,流速为10倍柱体积/小时,收集流穿液。
注意:- 本试剂盒中附带有一块筛板,使用时先将筛板加至填料的上层,再将处理好的上清负载上柱。该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤,防止过多的杂蛋白堵塞柱子,但是筛板放入柱子后不易取出。
- 通过控制加入的上清(菌体裂解液)的速度来控制流速。
- 本试剂盒中附带有一块筛板,使用时先将筛板加至填料的上层,再将处理好的上清负载上柱。该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤,防止过多的杂蛋白堵塞柱子,但是筛板放入柱子后不易取出。
- 使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子,洗去杂蛋白。
- 使用适量Elution Buffer洗脱,收集洗脱峰。
注意:通过蛋白监测仪监测,洗脱峰可以分管收集,每1mL收集1管。 - 洗脱后,依次使用5倍柱体积的Binding Buffer,5倍柱体积的去离子水洗涤柱子,再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没),封柱后2~8℃保存。
注意:- 在纯化包涵体蛋白时,所有缓冲液均含有变性剂,可以降低Binding Buffer中的咪唑浓度(比5mM更低)。洗脱时,若蛋白在较高pH下洗脱失败,可以选用低pH缓冲液作为洗脱缓冲液(pH6.5,pH5.9或pH4.5)。
- 如果是分段梯度洗脱,最大洗脱缓冲液中咪唑浓度未达到500mM,则使用浓度为500mM的咪唑进行洗脱10倍柱体积后,再进行第8步的操作。
- 在纯化包涵体蛋白时,所有缓冲液均含有变性剂,可以降低Binding Buffer中的咪唑浓度(比5mM更低)。洗脱时,若蛋白在较高pH下洗脱失败,可以选用低pH缓冲液作为洗脱缓冲液(pH6.5,pH5.9或pH4.5)。
- 收集菌体后,每100mg菌体(湿重)加入2mL细菌裂解液(每1mL细菌裂解液中请预先加入10μL蛋白酶抑制剂混合物),如有需要可以超声裂解菌体。
- 柱再生
当填料使用多次后,结合效率会有所下降(表现为流速变慢或填料失去蓝绿色),可以用以下方法再生,提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。- 使用2倍柱体积的6M盐酸胍冲洗后,使用3倍柱体积的去离子水冲洗。
- 使用1倍柱体积的2% SDS冲洗。
- 依次使用1倍柱体积的25%、50%、75%和5倍柱体积的100%乙醇冲洗,再依次使用1倍柱体积的75%、50%和25%的乙醇冲洗。
- 使用1倍柱体积的去离子水冲洗。
- 使用5倍柱体积含50mM EDTA缓冲液(PH8.0)冲洗。
- 使用3倍柱体积去离子水,3倍柱体积20%乙醇冲洗。
- 2~8℃保存。
- 再次使用前,需首先使用10倍柱体积去离子水冲洗,然后使用5个柱体积的50mM NiSO4再生,3个柱体积的Binding Buffer平衡。
- 使用2倍柱体积的6M盐酸胍冲洗后,使用3倍柱体积的去离子水冲洗。
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