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本制品是一种GST标签蛋白纯化树脂，结构上以6%交联的琼脂糖凝胶为基质，通过12个原子的间隔臂，用化学方法共价结合还原型谷胱甘肽制作而成。该设计使树脂的纯化效率得到了较大提高，使其每毫升基质可承载>20mg GST融合蛋白。

本制品特异性好，性价比高，可以一步纯化各种表达系统中谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽依赖性蛋白和谷胱甘肽重组衍生物。

• 请勿冷冻保存本制品。
  
• gStar Glutathione Agarose Resin使用前一定要充分颠倒若干次，使琼脂糖珠混合均匀。
  
• 所有操作过程中，样本需要在4℃或冰上操作。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 所用水和Buffer在使用前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤除菌。
  
• 结合/洗杂缓冲液：140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.4。
  
  • 平衡/洗杂缓冲液或洗脱缓冲液中可加入1～10mM DTT。
• 洗脱缓冲液：用平衡液配制10mM还原型谷胱甘肽(现配现用)。

• 样品在上样前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质以防阻塞柱子。

• 样品准备：
  
  • 细菌表达的蛋白：
    
    • 本说明以细菌表达蛋白为例。
    • 挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
      
    • 表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体，然后加入1/10体积的平衡液和PMSF(PMSF在破碎前加入，其终浓度为1mM)，同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
      
    • 之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1mg/mL。
      
      • 如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
    • 将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高，可考虑加入10μg/mL RNase A和5μg/mL DNase I)，混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
      
    • 收集上述澄清蛋白液，10000rpm，4℃离心20～30min。取上清，0.22μm/0.45μm滤膜过滤后，置于冰上备用或-20℃保存。
  • 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白：将细胞培养液转移至离心瓶，5000rpm离心10min，收集上清。即可直接上柱纯化；
    
    • 对于大量体积的上清，需加入硫酸铵进行沉淀浓缩，之后经平衡液透析后才能上柱。
• gStar Glutathione Agarose Resin重力柱的装填：
  
  • 取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。
    
  • 将gStar Glutathione Agarose Resin混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入重力柱中(填料实际体积占悬液的一半)，打开下出口流干保护液。
    
  • 加入适量纯水冲洗填料，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。
    
  • 加入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之间没有空隙，且保持水平。
    
  • 装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡，暂不使用时则加入保护液，4℃保存。
• 样品纯化：
  
  • 孵育法纯化：
    
    • 根据纯化的样品量，取适量gStar Glutathione Agarose Resin加入离心管中，1000rpm离心1min，吸弃上清；也可加入重力柱中，流干保护液。
      
    • 向离心管中加入5倍填料体积的平衡液清洗填料，1000rpm离心1min，吸弃上清；如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液；重复两次以上。
      
    • 加入样品，封闭离心管或重力柱管，4℃振荡孵育2~4h或者37℃孵育30min~2h。
      
    • 孵育结束后，1000rpm离心1min，吸弃上清，或过滤收集填料，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。
      
    • 用5倍填料体积的洗杂液清洗填料，1000rpm离心1min或重力柱管过滤，去除上清(注意不要吸到填料)，重复3～5次，中间建议更换新离心管。
      
    • 加入3～5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育5min，1000rpm离心1min或重力柱管收集洗脱液，可重复2～3次。
  • 重力柱法纯化：
    
    • 将装填好gStar Glutathione Agarose Resin的重力柱用5倍柱体积平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下，重复2～3次。
      
    • 将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2min，保证样品和填料充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。
      
    • 用10～15倍柱体积的洗杂液进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
      
    • 用5～10倍柱体积的洗脱液洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。
      
    • 随后依次用3倍柱体积的平衡液和5倍柱体积的去离子水清洗填料。5倍柱体积的20%乙醇平衡填料，最后将填料保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。
• SDS-PAGE检测：将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。
  
• 填料清洗：GST标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异结合蛋白的增多和蛋白的聚集，会造成流速和结合载量性能下降，此时需对填料进行清洗。
  
  • 去除一些沉淀或变形物质：用2倍柱体积的6M盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH7.4清洗。
    
  • 去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质：用3～4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH7.4清洗。