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本试剂盒可用于比色皿法检测，也可用于微孔板法检测。前者虽需较大量（100μL）的蛋白样品，但由于其在检测中使用蛋白样品与BCA工作液的比率为1:20（v/v），从而降低干扰物质带来的影响。后者操作简单方便，仅需少量（10～25μL）的蛋白样品。不过，由于其在检测中使用蛋白样品与BCA工作液的比率为1:8（v/v），某种程度上限制干扰物质的承受浓度以及降低最低检测水平。试剂盒中提供的蛋白标准品为用户制作标准曲线提供了便利。

• 灵敏度高，最小检测蛋白量可达0.2μg，检测浓度下限达到10μg/mL。
  
• 速度快，比一般的BCA蛋白浓度测定试剂盒显色所用时间短。比传统的Lowry法检测速度约快4倍。
  
• 线性范围广，20～2000μg/mL浓度范围内有较好的线性范围。
  
• 不受大部分样品中的化学物质的影响，详情见附表1。

• 使用BCA蛋白测定法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，因此需注意保持定时和定温，以确保精确定量。
  
• 低温或长期保存，若发现BCA试剂A或者试剂B有沉淀发生。请37℃温育并伴随搅拌促使其充分溶解。如发现细菌污染，则应丢弃，避免对实验结果造成影响。
  
• 实验操作规范，提高上样量的精确度。
  
• 每次测定都需做相应的标准曲线，因为显色反应与温度和时间的变化有关，精准的蛋白定量宜每次都做标准曲线。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 配制BSA标准品体系
  标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS进行稀释。BSA标准品体系配制可参考表1和表2。
  表1：BSA标准品体系配制（比色皿检测，线性范围20～2000μg/mL）
  

  Vial	稀释液体积(μL)	2mg/mL BSA体积(μL)	BSA终浓度(μg/mL)
  A	0	100	2000
  B	25	75	1500
  C	50	50	1000
  D	125	75	750
  E	150	50	500
  F	350	50	250
  G	375	25	125
  H	395	5	25
  I	400	0	0=Blank

  注：如用比色皿检测，每管需加100μL标准品，按3个重复计算，每个浓度至少需配制300μL。
  表2：BSA标准品体系配制（微孔板检测，线性范围20～2000μg/mL）
  

  Vial	稀释液体积(μL)	2mg/mL BSA体积(μL)	BSA终浓度(μg/mL)
  A	0	30	2000
  B	9	21	1400
  C	12	18	1200
  D	15	15	1000
  E	21	9	600
  F	24	6	400
  G	27	3	200
  H	49	1	40
  I	30	0	0=Blank

• 配制BCA工作液
  • 计算所需要的总BCA工作液体积。
    总BCA工作液体积=（标准品+待测样品）×重复数×每个样品所需要的BCA工作液
    注：比色皿检测时每个样品加2.0mL BCA工作液，微孔板检测每个样品加200μL BCA工作液。
    
  • 配制BCA工作液：50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B（A:B=50:1），充分混匀。
    注：BCA试剂B加入BCA试剂A中后，迅速浑浊，通过混匀后立即变澄清。BCA工作液装入密封容器内，室温条件24h稳定。

• 比色皿检测方法（样品：BCA工作液=1:20）
  
  • 各取100μL标准品和待测样品加入到反应管中。
    
  • 每管加入2.0mL BCA工作液，混匀。37℃孵育30min。
    注：也可室温孵育2h，或者60℃孵育30min。BCA检测蛋白浓度，延长孵育时间会加深颜色反应。升高温度会加快显色反应。但是温度升高和时间延长会降低检测下限，以及降低工作线性范围。若蛋白浓度很低，可在较高温度孵育或者适当延长孵育时间。
    
  • 冷却到室温。分光光度计检测，设定波长为562nm。用装满水的比色皿对仪器校零。在10分钟内对所有样品读数。
    注：由于BCA反应达不到真正的反应终点，即使温度降低至室温生色反应液会继续。但是，由于室温下生色比率相当低，因此若是10min内能对所有的样本进行562nm吸光度的测试，不会导致明显错误。
    
  • 根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度ug/mL；Y-最终的OD562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
• 微孔板检测方法（样品：BCA工作液=1:8）
  
  • 各取25μL标准品和待测样品加入到微孔板中。
    注：样品与工作液比例为1:8，若样品有限，可使用10μL标准品和待检测样品进行检测（即1:20），这时试剂盒的检测范围为125～2000μg/mL。
    
  • 每孔加入200μL BCA工作液，振荡30s充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30min。
    
  • 冷却到室温，在酶标仪上的540～595nm波长范围处检测吸光度，其中562nm波长为最佳。
    注：
    ① 由于酶标板的光径比比色皿短，使得酶标板检测需要更好的样品：BCA工作比率来获得相同的检测灵敏度。若使用高于562nm的检测波长，建议延长孵育时间到2h。
    ② 延长孵育时间或者提高样品：BCA工作比会增高每个孔的OD562nm净值，并且降低检测下限和工作线性范围。
    
  • 根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度ug/mL；Y-最终的OD562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。