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本试剂盒的原理与传统BCA蛋白定量法类似，但采用了一种不同于BCA的全新特殊的螯合剂，从而实现了对蛋白质浓度进行快速、稳定、灵敏的测定。本试剂盒含有一系列浓度的蛋白质标准品溶液(BSA溶液)，即取即用，无需稀释，方便快捷。

本试剂盒的原理是在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu²⁺形成络合物，将Cu²⁺还原成Cu⁺，Cu⁺与螯合物结合，从而发生颜色反应。本试剂盒中的螯合剂可敏感特异地与Cu⁺结合，只需室温孵育5min即可形成稳定的橙黄色水溶性复合物，而传统BCA法则需在37℃下孵育30min才可完成颜色反应。该橙黄色的复合物在480nm处有强光吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来测定蛋白质的含量。

• 简单快速：室温5min完成显色反应。
  
• 方便快捷：提供即用型标准品，省去繁琐的稀释步骤。
  
• 准确性高：变异系数远小于考马斯亮蓝染色法。
  
• 线性范围宽：20～2000μg/mL。
  
• 兼容性好：与金属离子、还原剂、螯合剂及去污剂兼容性较好。

• 本制品可以采用酶标仪(微孔检测法)或者分光光度计(试管检测法)测定蛋白浓度，如使用普通的分光光度计测定，需根据比色皿的最小检测体积，适当加大BCA工作液的用量使其不小于最小检测体积，样品和标准品的用量可相应按比例放大。使用分光光度计测定蛋白浓度时，每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少。
  
• 建议每次测定蛋白样品时，都须绘制标准曲线，以获得准确数据。
  
• 完成室温孵育5min后，须在20～30min内完成检测，否则会影响蛋白定量的准确度。
  
• 如待测样品中含较多的干扰物质(具体前页附表)，可采用其它蛋白定量产品。

• 配制显色工作液：
  
  • 计算显色工作液总量：
    工作液总量=(BSA标准品样本个数＋待测样本个数)×复孔数×每个样本显色工作液体积
    举例：BSA标准品样本个数为8个，待测样本个数3个，复孔数3个。
    显色工作液总量=(8个BSA标准品样本＋3个待测样本)×3个复孔×200μL(每个样本工作液体积)=6.6mL
    
  • 根据计算出的所需显色工作液用量，将试剂A和试剂B按照50:1的体积比，配制显色工作液，充分混匀。
    
    • 试剂B刚加入试剂A时，会出现灰蓝色沉淀，但只需混匀几秒钟，沉淀就会消失，形成透亮的绿色溶液。
      
    • 建议工作液现用现配，在室温下，工作液会逐渐变为深绿色，但只要在1.5h内使用，对定量的准确性不会造成影响。
      
    • 由于加样可能存在误差，建议配制BCA工作液时，多配制1～2个孔。
• 定量检测：
  
  • 分别取即用型BSA标准品1～8各20μL加到96孔板中。
    

    孔号	1	2	3	4	5	6	7	8
    添加物	标准品1	标准品2	标准品3	标准品4	标准品5	标准品6	标准品7	标准品8
    体积	20μL
    BSA终浓度(μg/mL)	0	125	250	500	750	1000	1500	2000

    BSA标准品使用前须充分溶解摇匀。
    
    
  • 用1×PBS或0.9%生理盐水将样品适当稀释(可以多作几个梯度，如2倍、4倍、8倍稀释)，加20μL到96孔板的样品孔中。
    
  • 各孔加入200μL显色工作液，充分混匀，盖上96孔板盖，室温孵育5min，即可进行检测。
    
    由于颜色反应速度较快，须保证在20～30min之内完成读值。如果必须在30min后才能读值，可提前加入50μL 1M HCl终止反应。
    
    
  • 用酶标仪测定每个样品及BSA标准品的A480，注意要减去空白对照(标准品1 ＋工作液)的A480。
    
  • 绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。
    
    数据处理时需要去除明显错误的值。待测样品浓度可以从标准曲线中查得，实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。如果是计算机绘制的曲线，可以从计算机给出的线性方程式计算出待测样品的浓度。