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本制品是基于BCA法研制而成，实现了对蛋白质进行快速、稳定、灵敏的浓度测定。本试剂盒含有牛血清白蛋白(BSA)溶液作为蛋白质标准品溶液。

BCA蛋白定量法是目前广泛使用的蛋白定量方法之一，其原理是在碱性环境下蛋白质分子中的肽链结构能与Cu²⁺络合生成络合物，同时将Cu²⁺还原成Cu⁺，BCA试剂可敏感特异地与Cu⁺结合，形成稳定的有颜色的复合物，其在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来测定蛋白质的含量。

• 准确性高：变异系数远小于考马斯亮蓝染色法。
  
• 线性范围宽：20～2000μg/mL。
  
• 兼容性好：与金属离子、还原剂、螯合剂及去污剂兼容性较好。

• 本制品可以采用酶标仪(微孔检测法)或者分光光度计(试管检测法)测定蛋白浓度，如使用普通的分光光度计测定，需根据比色皿的最小检测体积，适当加大BCA工作液的用量使其不小于最小检测体积，样品和标准品的用量可相应按比例放大。使用分光光度计测定蛋白浓度时，每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少。
  
• 试剂在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37℃温育使其溶解。
  
• 建议每次测定蛋白样品时，都须绘制标准曲线，以获得准确数据。
  
• BSA标准品的稀释液需与待测样品的稀释液一致(可用1×PBS或0.9%生理盐水进行稀释)。
  
• 如待测样品中含较多的干扰物质(具体见附表)，可采用其它蛋白定量产品。

• 稀释BSA标准品：取120μL蛋白标准品(需完全融解)，用与待测蛋白样品相一致的稀释液稀释至300μL，使终浓度为2mg/mL。
  
  为方便起见，也可以用0.9%生理盐水或PBS缓冲液稀释标准品。
  
  
• 配制显色工作液：
  
  • 计算显色工作液总量：
    工作液总量= (BSA标准品样本个数＋待测样本个数)×复孔数×每个样本显色工作液体积
    举例：BSA标准品样本个数为9个，待测样本个数3个，复孔数3个。
    显色工作液总量= (9个BSA标准品样本＋3个待测样本)×3个复孔×200μL(每个样本工作液体积)=7.2mL
    
  • 根据计算出的所需显色工作液用量，将试剂A和试剂B按照50:1的体积比，配制显色工作液，充分混匀。
  • 由于加样可能存在误差，建议配制BCA工作液时，多配制1～2个孔的量。
    
  • 新配制的BCA工作液室温密封条件下可稳定保存24h。
• 定量检测：
  
  • 将稀释后的标准品按0、1、2、4、6、8、10、15、20μL分别加到96孔板中，加入用于稀释标准品的溶液补足到20μL。
    

    孔号	1	2	3	4	5	6	7	8	9
    稀释后的标准品(μL)	0	1	2	4	6	8	10	15	20
    稀释液(μL)	20	19	18	16	14	12	10	5	0
    BSA终浓度(μg/mL)	0	100	200	400	600	800	1000	1500	2000

    为避免枪尖损失，可先补足稀释液后加入标准品。
    
    
  • 将样品适当稀释(可以多作几个梯度，如2倍、4倍、8倍稀释)，加20μL到96孔板的样品孔中。
    
  • 各孔加入200μL显色工作液，充分混匀，盖上96孔板盖，37℃孵育30min，冷却至室温。
    
    也可以室温放置2h，或60℃放置30min。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果蛋白浓度较低，可在较高温度孵育，或延长孵育时间。
    
    
    
  • 用酶标仪测定每个样品及BSA标准品的A562，或540～590nm之间的其它波长的吸光度，注意要减去空白对照(稀释液＋工作液)的吸光度。
    
  • 绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。
    
    数据处理时需要去除明显错误的值。待测样品浓度可以从标准曲线中查得，实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。如果是计算机绘制的曲线，可以从计算机给出的线性方程式计算出待测样品的浓度。