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本试剂盒采用不含去垢剂的裂解缓冲液，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后结合离心柱离心，有效破坏细胞膜，释放出细胞内蛋白，然后通过离心得到活性蛋白。另外，裂解缓冲液中也不含有还原剂如DTT和BME等，能有效保持蛋白的天然结构。使用该产品提取的蛋白可以用于普通非变性电泳（Laemmli系统）或Blue Native系统。

本试剂盒主要提取得到的是胞浆内的可溶性蛋白，对细胞膜蛋白，细胞器蛋白，细胞核蛋白提取效率不高，不建议使用。

蛋白提取过程中经常使用去垢剂裂解细胞，如NP-40、Triton X-100、SDS等。然而这些去垢剂会对提取的蛋白后续功能研究产生影响。如去垢剂会影响蛋白的荧光标记；高浓度的去垢剂会影响蛋白互作研究；阴离子去垢剂如SDS提取得到变性蛋白，不利于蛋白活性研究；含去垢剂的蛋白样品能与考马斯亮蓝G-250结合，影响Blue Native电泳的分离效果。

对于细胞样品，如果每个样品的数量为5×10⁶个细胞，本试剂盒可用于50个样品的蛋白提取实验。

• 离心机请调整成RCF/g模式，按照离心力设置离心机（不要根据转速rpm模式设置），所有离心步骤都需要在4℃低温离心机中进行。
  
• 溶液混匀后放置于冰上。将离心柱套入2mL连盖收集管中，盖好管盖，放置于冰上预冷。
  
• 蛋白提取推荐添加蛋白酶抑制剂（自备，试剂盒不提供），根据蛋白酶抑制剂母液浓度提前添加在裂解缓冲液中（添加时按照1:100添加，即1mL裂解缓冲液添加10μL抑制剂）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制剂（自备，试剂盒不提供）。
  
• 蛋白定量推荐使用BCA方法，可以选择BCA蛋白浓度试剂盒。

• 即用型裂解缓冲液配制：取适当体积的预冷裂解缓冲液，在使用前数分钟内加入用户自备的1/100体积的100×蛋白酶抑制剂，如果进行蛋白磷酸化研究，需要加入用户自备的1/100体积的100×磷酸酶抑制剂，随后立即放于冰上待用（30分钟内使用）。按照下表大体估算裂解缓冲液使用体积：
  

  细胞类型	培养器皿	细胞数量	细胞沉淀体积(μL)	裂解缓冲液(μL)
  悬浮细胞		5～10×106	＞50	500
  		2～5×106	20～50	200
  贴壁细胞	96孔板	~1×105	调整细胞数目到2～5×106
  	24孔板	~5×105	调整细胞数目到2～5×106
  	6孔板	~2.5×106	~25
  	25cm2培养瓶	~2×106	~20
  	75cm2培养瓶	~8×106	~80
  	35mm培养皿	~2×106	~20
  	60mm培养皿	~5×106	~50
  	100mm培养皿	~1.5×107	调整细胞数目到2～5×106

  • (二百万，2×10⁶)HeLa细胞，其细胞沉淀体积（PCV）大约为20μL。
• 准备细胞：
  
  • 对于贴壁细胞：细胞用PBS漂洗一遍，弃PBS；再加入适量PBS，用细胞刮刀刮下细胞，或用0.02% EDTA（0.5mM）溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。400g（~2000rpm） 4℃离心5min收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
    
  • 对于悬浮细胞：400g（~2000rpm）4℃离心5min收集细胞，用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
• 裂解细胞膜：
  
  • 细胞沉淀中加入准备好的裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），用移液器吹打重悬细胞沉淀，涡旋剧烈震荡30～60秒，冰浴处理10分钟，间歇2～3次混匀。
    
    • 裂解缓冲液使用推荐经验值：起始细胞数低于5×10⁶加入200μL裂解缓冲液，起始细胞数在5×10⁶～1×10⁷之间加入500μL。如果细胞数目低于10⁶或高于10⁷，建议调整细胞数目在2～5×10⁶范围内。
  • 将细胞悬液转移到离心柱中，盖上管盖，16000g（~13000rpm） 4℃离心1分钟，离心后可见收集管底部有沉淀形成。
    
    • 离心柱最大体积为600μL；确保离心机转速可以在1分钟内升速到16000g。
  • 弃去离心柱，盖好2mL收集管管盖，用1mL移液器轻柔吹打重悬收集管中的沉淀。
• 去除细胞核和未破碎的细胞：将悬浮溶液16000g（~13000rpm） 4℃离心15分钟。
  
• 收集上清：收集上清即为胞浆蛋白，其蛋白浓度约为0.5～2μg/μl，不同细胞略有不同。
  
  • 关键步骤：吸取上清时不要触及沉淀，甚至可以丢弃部分上清不吸取，以免上清中污染其他蛋白。