产品目录

本制品适用于BN蛋白电泳后凝胶上非变性蛋白的转膜。本转膜液配制便捷，稀释后无需调节pH值，pH约为7.5-7.7。该缓冲液最终可配成10升即用型1×缓冲液（根据需求补加甲醇）。

Blue Native PAGE（BN-PAGE）是一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离分子量10kD-10M kD范围的蛋白质复合物的电泳技术。其原理是用温和去污剂(如DDM，digitonin)将蛋白复合体从细胞膜中以近似天然的状态分离出来，BN-PAGE是用考马斯亮蓝G-250代替SDS与蛋白结合而使其带负电荷，根据蛋白分子量不同在PAGE胶中得到分离。BN-PAGE由于考马斯亮蓝G-250存在，使蛋白都覆盖上负电荷，可以分离碱性蛋白（pI＞7）。

• 将10×转膜缓冲液粉末全部溶解于1升超纯水中，彻底溶解，即配成10×转膜缓冲液。
  
  • 配成10×转膜缓冲液后4℃贮存，一年有效。
• 根据下表配制成1×即用型转膜缓冲液
  

  	1×即用型转膜缓冲液
  	500mL	1L	2L
  10×转膜缓冲液	50mL	100mL	200mL
  无水甲醇	甲醇终浓度0～20%
  超纯水	定容至500mL	定容至1升	定容至2升
  	不要调节pH

  • 加入甲醇的即用型转膜缓冲液4℃贮存，一个月有效。
    
  • 转膜缓冲液中加入甲醇对蛋白有固定作用，转膜分子量较大的蛋白少加或不加甲醇，转膜分子量较小的蛋白要加至多20%的甲醇。非变性蛋白的转膜可以不加甲醇。

• 电泳后凝胶预处理(可选步骤)：
  凝胶浸泡于适量1×即用型BN转膜缓冲液（加终浓度0.1% SDS）中，摇床慢摇10分钟。
  
  • 凝胶浸泡在含SDS缓冲液中，能让蛋白带上更多的负电荷，有利于蛋白的转膜。
• 转膜：
  
  • 转膜方法：BN电泳后的转膜建议用湿转法。
    
  • 膜的选择：BN电泳转膜必须使用PVDF膜，不能用NC膜（NC膜会与考马斯亮蓝G-250不可逆结合，很难清除干净）。根据蛋白大小选择膜的孔径。一般说来，大于20kD蛋白选择0.45μm孔径，低于20kD选择0.22μm孔径。PVDF膜使用前要用无水甲醇润湿活化。
    
  • 三明治结构：转膜三明治结构与传统转膜相同，即根据“黑胶白膜”制作三明治，即膜置于转膜夹芯正极一侧，凝胶置于转膜夹芯负极一侧，这样凝胶上带负电荷的蛋白才能转移到膜上。
    蛋白转膜三明治制作：
    负极（电转夹黑色面）-海绵垫-1层1mm厚度滤纸-凝胶-膜-1层1mm厚度滤纸-海绵垫-正极（电转夹白色面）
    
    
  • 转膜条件：
    由于在非变性条件下，不同蛋白的空间结构，聚合状态，电荷数量都有不同，以下转膜条件仅供参考，客户针对自己的目的蛋白，最好经过1～2次预实验后，确定最佳的转膜条件。
    

    蛋白大小	稳流	建议时间	降温措施
    低于70kD	150 mA	1小时	不需要
    70～300kD	200 mA	1.5～2小时	需要
    高于300kD	200 mA	2.5～3.5小时	需要

• 洗膜：PVDF膜用无水甲醇清洗10分钟，彻底去除蓝色G250。
  
• 进行后续WB操作：封闭-一抗-二抗-检测。