产品货号：
RFT220
中文名称：
碱性蛋白Native-PAGE胶制备及电泳试剂盒
英文名称：
Basic Protein Native PAGE Gel Preparation and Electrophoresis Kit
产品规格：
50T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒包含碱性蛋白凝胶制备及电泳所需的全部试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水，可用于配制碱性蛋白非变性PAGE凝胶。
各种蛋白质分子由于所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不同，因而有各自的等电点。凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质称为碱性蛋白质，等电点偏碱性，如组蛋白、精蛋白等。反之，凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏酸性。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
- 由于本系统采用非连续凝胶系统，分离胶pH为4.3，因此要求待分离的蛋白等电点pI＞7.0，这样碱性蛋白在酸性凝胶系统内带正电荷，在凝胶电泳中才能正常向阴极泳动。如果待分离的蛋白等电点pI＜7.0，请选择非连续Laemmli活性凝胶系统分离(Native-PAGE胶制备试剂盒，货号：RFT219)
- 本试剂盒不适用于总蛋白样品的电泳，也不适用于总蛋白分离后的Wstern Blot检测；推荐应用于纯化后的碱性蛋白电泳。
| 组分 | 规格 | 保存 |
| 5×碱性蛋白电泳缓冲液(干粉) | 1L | RT |
| APS(干粉) | 0.5g | |
| TEMED | 0.5mL | 4℃ |
| 30% PAA(29:1) | 100mL | |
| 4×碱性蛋白分离胶缓冲液(pH4.3) | 100mL | |
| 4×碱性蛋白浓缩胶缓冲液(pH6.8) | 50mL | |
| 100×分离胶促凝剂 | 2.5mL | -20℃ |
| 5×甲基绿上样缓冲液 | 1mL |
保存：收到后按标签温度分开保存，有效期1年。
本试剂盒可配制30～50块常规大小的非变性PAGE胶。
- 10% APS的配制：配制分离胶前，将0.5g APS干粉溶于5mL灭菌水中，彻底溶解后分装，1mL/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20℃保存的10% APS。
- 5×碱性蛋白电泳缓冲液的配制：将5×碱性蛋白电泳缓冲液(干粉)全部倒入1L烧杯中，加入约900mL水彻底溶解，加入冰醋酸11mL，用水定容至1L，即配成5×碱性蛋白电泳缓冲液，此溶液pH值约为4.4。
根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度（表一），配制非变性PAGE的分离胶。
表一：不同浓度的PAGE分离胶的最佳分离范围
| PAGE分离胶浓度 | 最佳分离范围 |
| 6% | 50～150kD |
| 8% | 30～90kD |
| 10% | 20～80kD |
| 12% | 12～60kD |
| 15% | 10～40kD |
- 配制分离胶
- 根据表二，将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
表二：配制不同浓度分离胶所需各组分的体积成分 分离胶浓度 6% 8% 10% 12% 15% 灭菌水 2.7mL 2.4mL 2mL 1.7mL 1.2mL 4×碱性蛋白分离胶缓冲液(pH4.3) 1.25mL 30% PAA(29:1) 1mL 1.3mL 1.7mL 2mL 2.5mL 100×分离胶促凝剂 50μL TEMED 5μL 10% APS 50μL - 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5cm的水层，使凝胶表面保持平整。
- 静置15～30分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。
- 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
- 根据表二，将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
- 浓缩胶制备
- 去除覆盖在分离胶上的水层。
- 按照表三将不同成分在一个小烧杯或试管中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
表三：碱性蛋白Native-PAGE浓缩胶(5%)配方表成分 用量 灭菌水 1.15mL 4×碱性蛋白浓缩胶缓冲液(pH6.8) 500μL 30% PAA(29:1) 330μL TEMED 2μL 10% APS 20μL - 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
- 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
- 静置30～60分钟，等待浓缩胶聚合。
- 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
- 去除覆盖在分离胶上的水层。
- 电泳
凝胶凝固好后，将5×碱性蛋白电泳缓冲液稀释5倍即配成1×碱性蛋白电泳缓冲液。在电泳槽的内槽内加入1×碱性蛋白电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×碱性蛋白电泳缓冲液。上样，把电泳电源的电源线互换，即红色的阳极电极查到阴极孔，黑色的阴极电极插到阳极孔，按照表四条件，电泳，等指示前沿甲基绿电泳到分离胶下缘后，结束电泳，染色或者进行下一步实验。
表四：碱性蛋白电泳条件恒电压 150V 起始电流 30～40mA/板胶 结束电流 10～20mA/板胶 电泳时间 40～45分钟
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| 12%碱性蛋白分离胶，150V，42-17mA，40min | Native-Page蛋白上样量为3μg Lane1：His融合蛋白，45.5kD(SDS-PAGE),pI7.85 Lane2：His融合蛋白，47kD(SDS-PAGE),pI7.29 Lane3：BSA |
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