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本制品是百奥莱博供公司基于BCA方法推出的专门用于去垢剂浓度高的样品中蛋白浓度高灵敏定量检测的试剂盒。

蛋白质分子中肽键结构在碱性环境下能与Cu²⁺生产络合物，并将Cu²⁺还原成Cu⁺，而BCA试剂可以特异性地与Cu⁺结合，形成稳定的有颜色的复合物，并在562nm处有最大的光吸收值，该复合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可以根据吸收值的大小来测定蛋白的含量。

• 灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/mL（在20～1000μg/mL浓度范围内有较好的线性关系），最小检测蛋白量达到0.2μg，待测样品体积为1～20μL。
  
• BCA法测定蛋白浓度的最大优点是蛋白浓度的测定可以耐受高浓度的去垢剂，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20,60,80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于0.01%。

• BCA工作液室温可放置一周不失效。

• 微孔板测定程序：（工作范围20～2000μg/mL）
  
  • 蛋白标准品配制：室温完全溶解蛋白标准品，取20μL 5mg/mL BSA蛋白标准溶液用PBS溶液稀释至100μL，使其终浓度为1.0mg/mL。
    
  • 按照下表配制BSA标准测定溶液：
    

    编号	0	1	2	3	4	5	6	7	8
    BSA标准溶液(μL)	1mg/mL BSA(μL)							5mg/mL BSA(μL)
    	0	0.5	2.5	5.0	10	15	20	6	8
    PBS溶液(μL)	20	19.5	17.5	15	10	5	0	14	12
    BSA终浓度(μg/mL)	0	25	125	250	500	750	1000	1500	2000
    总体积(μL)	20μL

  • 将适当体积的待测样品加入到微孔板中，并用PBS补足到20μL
    
  • 向微孔板中加入200μL BCA工作液，混匀，37℃放置30分钟；
    
    • 也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。
  • 测定562nm处的吸光值，并记录读数；以不含BSA的样品的光吸收值作为空白对照。
    
  • 以A562为纵坐标，BSA含量为横坐标，绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。如果所得到的蛋白浓度不在标准曲线范围内，请稀释样品后重新测定。
• 试管测定程序：（工作范围20～1000μg/mL）
  
  • 蛋白标准品配制：室温完全溶解蛋白标准品，取150μL 5mg/mL BSA蛋白标准溶液，加入600μL PBS溶液稀释至750μL，使其终浓度为1.0mg/mL。
    
  • 按照下表配制BSA标准测定溶液：
    

    编号	0	1	2	3	4	5	6	7	8
    BSA标准溶液(μL)	1mg/mL BSA(μL)							5mg/mL BSA(μL)
    	0	2.5	12.5	25	50	75	100	30	40
    PBS溶液(μL)	100	97.5	87.5	75	50	25	0	70	60
    BSA终浓度(μg/mL)	0	25	125	250	500	750	1000	1500	2000
    总体积(μL)	100μL

  • 将适当体积的待测样品加入到试管中，并用PBS补足到100μL；
    
  • 向试管中加入2mL BCA工作液，混匀，37℃放置30分钟；
    
    • 也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。
  • 测定562nm处的吸光值，并记录读数；以不含BSA的样品的光吸收值作为空白对照。
    
  • 以A562为纵坐标，BSA含量为横坐标，绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。如果所得到的蛋白浓度不在标准曲线范围内，请稀释样品后重新测定。