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在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(FolIn试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5～100μg蛋白质。

• Folin-酚试剂甲：
  将1g Na₂CO₃溶于50mL 0.2moL/L NaOH中，再把0.5g(硫酸铜)CuSO₄·5H₂O溶于100mL 1%的酒石酸钾钠(或酒石酸钠)溶液，然后将前者50mL与后者1mL混合，现用现配，此试剂只能使用一天，过期失效。
  
• Folin-酚试剂乙：
  本试剂的浓度为1moL/L，此为Folin-酚试剂应用液。Folin-酚试剂平时应密封贮存于4℃冰箱中避光保存。

• 标准曲线的制作：
  

  取14支试管分成两组，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL标准蛋白质溶液(250μg/mL)，用水补足到1mL，加入5mL试剂甲，混匀，于20～25℃放置10分钟，再加入0.5mL试剂乙，立即摇匀，在20～25℃保温30分钟，然后于500nm处比色。测定光密度值，取两组测定的平均值，以蛋白质浓度为横座标，光密度值为纵座标，绘制标准曲线值为定量的依据。

  
  
• 样品测定：
  

  取1mL样品溶液（约合20～250μg/多肽或蛋白质）加入5mL试剂甲混匀，于20～25℃放置10分钟，再加0.5mL试剂乙（Folin-酚），立即摇匀，在20～25℃保温30分钟，然后于500nm处比色，以1mL水代替样品作空白对照。测定后，可以在标准曲线中查出未知样品的浓度。

  
  

  若用0.5cm光程的比色杯进行比色，可按下面方法进行操作：取0.2mL样品溶液（约含5～100μg多肽或蛋白质）加入1mL试剂甲（可选用0.3-0.5cm直径的小试管）混匀，10分钟以后，再加入0.1mL试剂乙，立即混匀，30分钟后比色。一般来说，若多肽或蛋白质的浓度在2～25μg，测波长755nm,，而25μg以上则采用500nm比色为宜。

• FolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。
  
• 福林酚仅在酸性条件下稳定，所以加入试剂乙后要立即混匀，在试剂乙被破坏之前完成反应，否则显色程度减弱。
  
• 用该方法测定蛋白浓度会受到蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。