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本试剂盒包含蛋白质标记染料和去除多余染料所需的全部组分。异硫氰酸荧光素(FITC)可以与蛋白质上的氨基，巯基，咪唑基，酪氨酰基和羰基发生交联反应。然而，只有伯胺和仲胺的衍生物才能产生稳定的标记产物。反应在pH8～9下效率最高，并且必须在无胺缓冲液如硼酸盐或碳酸盐/碳酸氢盐中进行。通常，蛋白质与15至20倍摩尔数的FITC反应，可导致几个FITC分子与一个蛋白质分子结合。装填有纯化树脂的离心柱简化了柱平衡、收集和监测重力流分的步骤。该系统能够有效去除多余的FITC，从而准确测定染料与蛋白的比例(F/P)和蛋白浓度。

• 操作简单，可在约一小时完成蛋白标记和纯化。
  
• 优化的F/P值。
  
• 无需称量微量粉末，试剂盒包含一次性试剂瓶。
  
• 高效的纯化试剂盒包括纯化树脂和离心柱，确保快速有效地去除未反应的染料并拥有优异的蛋白质回收率。

• FITC对湿度敏感。即用即配FITC标记试剂并丢弃未使用的部分。
  
• 低浓度的叠氮化钠(≤3mM或0.02%)或硫柳汞(≤0.02mM或0.01%)不会显着干扰蛋白质标记。但是，20～50%的甘油会降低标记效率。
  
• 避免使用含伯胺的缓冲液(例如Tris，甘氨酸)，因为它们与标记反应物竞争。

• 蛋白质制备
  注意：如果标记缓冲液在储存期间沉淀，则通过加热并涡旋使其溶解。为获得最佳效果，使用1mg蛋白质，浓度为~2mg/mL。准备蛋白质如下：
  a.在PBS中冻干的蛋白质：在使用前，用0.5mL标记缓冲液溶解1mg蛋白质。
  b.PBS中的蛋白质：可以直接用来标记。如果蛋白浓度＞2mg/mL，则用标记缓冲液(50mM硼酸钠)将浓度调节至2mg/mL。
  c.其他缓冲液中的蛋白质：蛋白质必须在不含铵离子或伯胺(例如Tris或甘氨酸)的缓冲液中。如有必要，用50mM硼酸钠通过透析置换缓冲体系。
  
• 蛋白质标记
  
  • 将所有试剂置于室温下。
    
  • 向FITC试剂小瓶中加入100μL DMSO，并上下晃动10次，短暂涡旋直至所有染料溶解，此时FITC浓度为10mg/mL。
    注意：试剂必须完全溶解才能进行有效标记。
    
  • 向制备的0.5mL蛋白质溶液中加入5μL步骤2的FITC溶液(10mg/mL)，上下晃动并短暂涡旋混匀。
    
  • 短暂离心，使样品汇集到收集管底部。
    
  • 将反应混合物在室温下避光孵育60～120分钟。
• 蛋白质纯化
  
  • 将两个离心型纯化柱底部的塑料塞拧下后，置于2mL收集管中。
    
  • 混匀纯化树脂，向两个离心型纯化柱内分别加入600μL悬液，可以通过弹击管壁的方法去除气泡。以~1000×g离心30秒以除去储存溶液。
    
  • 重复步骤二，加入悬液的同时重悬柱内的树脂，以~1000×g离心30秒再次去除纯化树脂的储存液，使之形成致密均一的纯化柱。丢弃用过的收集管并将柱子放入新的2mL圆底离心管中。
    
  • 向每个旋转柱中各加入250～270μL标记反应物，注意不可吹起树脂。
    
  • 以~1000×g离心柱30～45秒以收集纯化的蛋白质。合并两个离心管中的样品(总体积约0.5mL)，并丢弃使用过的离心柱。
    
  • 向标记的蛋白质添加1%(w/v) BSA和0.02%(w/v)叠氮钠在4℃下避光可保存长达一个月。或者，将标记的蛋白质一次性分装避光储存在-20℃，避免反复冻融。
• FITC与蛋白质比率计算
  
  • 使用PBS对FITC标记物进行稀释，测量吸光度A₂₈₀和A₄₉₅
    

    Molar F/P＝	2.77×A495	(仅适用于FITC-IgG标记产物)
    	A280－0.35×A495

    
    

    IgG(mg/mL)＝	A280－0.35×A495	(仅适用于FITC-IgG标记产物)
    	1.4

    
    其中1.4是大多数IgG在浓度为1.0mg/mL (pH7.0)的A₂₈₀
    
  • 当用于除IgG以外的蛋白质标记，可以参考下列公式进行计算：
    

    Molar F/P＝	MW	×	A495/195	＝	A495×C
    	389		A280－0.35×A495/E2800.1%		A280－0.35×A495

    
    其中，C＝MW×E₂₈₀^0.1%／389×195(C是对某一蛋白质特有的常数)；
    MW标记蛋白质相对分子质量；
    389 FITC相对分子质量；
    195结合E₂₈₀^0.1%的FITC在pH=13.0时的A₄₉₅；
    A₃₈₀－0.35×A₄₉₅是对A₂₈₀的吸光度校正；
    E₂₈₀^0.1%标记蛋白质在浓度为1.0mg/mL的A₂₈₀ (关于更多的E₂₈₀^0.1%和C值，请参考表一)；

• 蛋白质没有标记
  
  • 蛋白质缓冲液含有干扰标记的胺：
    通过透析或其他方法将缓冲液交换到50mM硼酸钠中。
    
  • FITC变质：
    即用即准备标记试剂，不要将试剂存放在水溶液中。
• 下游应用程序未成功
  
  • 蛋白质没有标记：
    通过计算FITC与蛋白质的比率来确定蛋白质是否被标记
• 样品或缓冲液未流出
  
  • 离心问题：
    确保离心机处于正常工作状态。
• 产量低
  
  • 离心不当：
    ① 确保使用指定的离心速度。
    ② 在树脂顶部加入40μL合适的缓冲液，重复离心步骤。
    
  • 蛋白质不稳定：
    用PBS或其他合适的缓冲液平衡柱。