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BCA法是目前应用比较广泛的蛋白浓度测定方法。基于双缩脲反应，即在碱性环境下蛋白质将Cu²⁺还原成Cu⁺，产生一种紫蓝色复合物，在562nm处有高的吸光值，该反应产物的量与蛋白浓度成正比。BCA蛋白浓度测定法实现了蛋白浓度测定的简便、灵敏、快速、稳定和高兼容性。

• 检测灵敏度高：最小检测蛋白量达到0.2μg，检测浓度下限达到10μg/mL。
  
• 检测速度快：比一般的BCA蛋白浓度测定试剂盒显色所用时间短。
  
• 线性范围宽：20～1000μg/mL浓度范围内有较好的线性关系。
  
• 兼容性好：不受绝大部分样品中化学物质的影响，对于5%以内的SDS，Triton X-100，Tween 20、60、80具有很好的兼容性。但BCA法受螯合剂和略高浓度的还原剂影响，需确保样品中EDTA＜10mM，DTT＜1mM，β-ME＜0.01%，以及不含EGTA。

• 蛋白标准BSA粉末溶解于蛋白标准配制液后，即获得蛋白标准原液，该原液中含有防腐剂，不影响后续检测，该蛋白标准原液应放在-20℃长期保存。
  
• 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中，否则待测蛋白与蛋白标准所含非蛋白成分不一致，有可能导致测定不准确。
  
• 待测蛋白和蛋白标准加入BCA工作液后，如果发现检测效果不佳，可以室温放置2h或60℃放置30min，颜色会随着时间的延长不断加深。显色反应也会随温度升高而加快。如果浓度较低，可以适当延长孵育时间或在较高温度下孵育。
  
• 测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加吸光度或颜色没有明显变化，可能的原因是样品中含有严重干扰BCA法测定蛋白浓度的物质（BCA法的兼容性）。
  
• 建议每次测定都做标准曲线。因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则如需精确测定宜每次都做标准曲线。
  
• 如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色皿的最小检测体积。应按比例适当加大BCA工作液的用量使总体积不小于最小检测体积，样品和标准品的用量亦相应按比例放大。
  
• 为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当加热，但是切勿过热，否则易失效。
  
• BCA法检测样本中不应含有EGTA，否则影响检测结果。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 蛋白标准品的准备：
  
  • 取1mL蛋白标准配制液加入到20mg蛋白标准BSA中，充分溶解后配制成20mg/mL的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，溶解后的蛋白标准溶液应-20℃长期保存。
    
  • 取适量20mg/mL蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/mL或所需浓度。例如取25μL 20mg/mL蛋白标准，加入975μL稀释液，充分混匀，即可配制成0.5mg/mL蛋白标准。
    
    • 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中。但为了简便起见，一般也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/mL蛋白标准可以-20℃长期保存。
• BCA工作液的配制：根据样品数量，按试剂A∶试剂B＝50∶1的比例配制BCA工作液，即取50份BCA试剂A和1份BCA试剂B，充分混匀，即获得BCA工作液。例如取5mL BCA试剂A和0.1mL BCA试剂B，配制成5.1mL BCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定。
  
• 蛋白浓度的测定：
  
  • 将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔，加标准品稀释液补足至20μL，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。
    
  • 加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20μL，加标准品稀释液补足到20μL，需注意记录样品体积。
    
  • 各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置20～30min。
    
    • 也可以室温放置2h，或60℃放置30min。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。
  • 酶标仪测定562nm波长处的吸光度（OD值），如无562nm，540～595nm波长范围的吸光度也可。
    
  • 根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线。依据标准曲线和使用样品体积计算样品的蛋白浓度。