产品货号:
KL220954
中文名称:
尿素PAGE电泳试剂盒(碱性蛋白分离)
英文名称:
Acetic Acid-Urea-PAGE Electrophoresis Kit
产品规格:
30T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本制品是专门用于乙酸-尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(AU-PAGE)的试剂盒,适用于分离等电点偏碱性的各种碱性蛋白,如嗜中性防御素、酪氨酸酶、鱼精蛋白、组蛋白以及这些碱性蛋白的各种修饰形式(如乙酰化、泛素化等),电泳后可直接用于考染、银染、Western杂交等实验。
- 一站式,即开即用,用户不需单独准备各种成分,十分方便。
- 采用不连续胶系统,分辨率高,能有效分离只有一个修饰基团不同的组蛋白。
- 使用光激发剂,故不需要进行长时间的预电泳。
包装 | 组分 | 规格 |
包装一 | 甲叉双丙烯酰胺干粉 | 2.5g |
TEMED | 10mL | |
氨水 | 10mL | |
尿素 | 250g×2 | |
pH指示剂 | 1mL | |
丙烯酰胺干粉 | 150g | |
乙酸 | 250mL | |
10×AU-PAGE电泳缓冲液 | 250mL | |
包装二 | 光激发剂 | 10mL |
上样液成分1 | 1g | |
AU-PAGE电泳示踪剂 | 1mL |
保存:包装一置于室温,包装二置于-20℃,有效期1年。
本试剂盒提供的试剂足够30次0.1cm×14cm×14cm大小的乙酸-尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳所需的量。
去离子水、透析袋(去除样本中的盐离子用)
一、试剂和样本准备工作
- 60%丙烯酰胺母液:加160mL自备去离子水到装有丙烯酰胺干粉的250mL棕色瓶中,终于体积为250mL。充分摇晃溶解(不能加热)。一次没用完的本溶液可以放4℃长期保存。
- 2.5%甲叉双丙烯酰胺母液:加100mL自备去离子水到装有甲叉双丙烯酰胺干粉的120mL本色瓶中,摇晃溶解(不能加热)。没用完的需4℃保存。
- 8M尿素母液:用本试剂盒提供的尿素干粉和自备的去离子水配制8M的尿素母液。如果配制10mL,则将4.8g尿素溶于少量水中,最后定容到10mL。没用完的本溶液需放-20℃保存,避免产生氰酸根离子。
- 待电泳的蛋白样本必须没有离子,故最好先用3500Da截留的透析袋在2.5%乙酸溶液中充分透析,然后分装成5~50μg/管,冷冻抽干。也可以用三氯乙酸沉淀,丙酮洗涤去盐离子。本试剂盒不提供相关试剂。
二、PAGE胶的配制
整个过程在常温操作,不能在低温操作。
- 下表是配制0.1×14×14cm大小PAGE胶所需各成分的用量。由于常见的碱性蛋白组蛋白和鱼精蛋白分子量都比较小,因此需用4%的浓缩胶浓度和15%的分离胶浓度。若胶大小变化或者碱性蛋白分子量较大,所配制的胶的体积和浓度需要相应调整。在两个容器中分别加入下列成分:
成分 15%分离胶 4%浓缩胶 60%丙烯酰胺溶液 8.6mL 0.67mL 2.5%甲叉双丙烯酰胺溶液 1.4mL 0.64mL 乙酸 2.1mL 0.57mL 尿素 16.8g 4.8g 去离子水 至33mL 至9.3mL - 灌分离胶:按上表配制分离胶,将溶液摇晃混匀,然后用真空泵接上管子抽真空15分钟去除溶液中的氧气,然后加入125μL氨水、175μL TEMED和2.38mL光激发剂,迅速摇匀并灌胶,在分离胶的液面距离胶板顶部5cm的时候,停止灌胶。加入1mL去离子水。由于分离胶比重较大,水将覆盖分离胶并使得胶面平整。将胶板放在强光下(如看X光片的灯箱前)促进光激发剂活动。室温聚合30~60分钟。凝固后倒出水,插入梳子。
- 灌浓缩胶:按上表配制分离胶,将溶液摇晃混匀,然后用真空泵接上管子抽真空15分钟去除溶液中的氧气,加入35μL氨水、50μL TEMED和650μL光激发剂,迅速摇匀并灌胶。将胶板放在明亮处,促进光激发剂活动。室温聚合30~60分钟。浓缩胶的高度有1~2cm即可。
三、电泳
整个过程在常温操作,不能在低温操作。
- 在等待胶凝固的过程中,配制上样液:在1.5mL塑料离心管中,加入7.7mg上样液成分1,0.9mL 8M尿素母液,50μL pH指示剂,50μL氨水。混匀后即得上样液。上样液只能现配现用,没有用完的不需要保留。
- 浓缩胶凝固后,拔出梳子,取出胶下面的隔条,将胶板上架到电泳槽上。先在下槽加入1×AU-PAGE电泳缓冲液。上槽的电泳缓冲液待上样后再加。
- 1×AU-PAGE电泳缓冲液由本试剂盒提供的10×AU-PAGE电泳缓冲液稀释而来,在1倍体积的10×AU-PAGE电泳缓冲液中加入9倍体积的去离子水,混匀后即可。1×AU-PAGE电泳缓冲液可以重复使用3次。
- 在第4步制备的冷冻干燥的蛋白样本中每管加入上步制备的上样液40μL,室温溶解5分钟。为避免尿素修饰蛋白,溶解时间不要超过5分钟。如果加入样本后,溶液不是粉红色,则表示蛋白样本中有残留乙酸使得pH过低,蛋白溶解不充分,需要补加氨水调到颜色变成粉红色,恢复碱性。
- 上样前每管补加2.5μL乙酸进行酸化,再加2μL AU-PAGE电泳示踪剂,补水到总体积为50μL。
- 补水多少取决于第10步加入了多少氨水调pH。
- 将50μL(含5~50μg总蛋白质)全部上样,多余的加样孔中要加入空白样本(40μL上样液+2.5μL乙酸+2μL AU-PAGE电泳示踪剂+5.5μL去离子水)以平衡电泳时各加样孔的盐离子浓度。
- 小心在上槽加满新鲜配制的AU-PAGE电泳液。加入了AU-PAGE电泳液后的凝胶必须立即使用,不得放置。
- 接电源线:AU-PAGE的电泳方法跟SDS-PAGE相反,故正极需要接到上槽,负极需要接到下槽。碱性蛋白在电泳体系中带正电,向负极移动。
- 固定电压到300 V电泳,如果是小的胶,可以固定电压到250 V电泳。在电泳过程中电流将逐渐降低。整个过程在常温操作,不能在低温操作。
- 当电泳示踪剂快到胶的边缘时停止电泳。
- 对AU-PAGE胶进行考染(本试剂盒不含考染相关试剂):将5g考马斯亮蓝R-250溶解在500mL脱色液(20%甲醛,7%乙酸)中,如果有不溶解的颗粒可以过滤去除,放入AU-PAGE胶后摇晃1小时。然后在脱色液(20%甲醛,7%乙酸)中脱色直到调条带显现。
- 常见的碱性蛋白Histone和鱼精蛋白分子量都比较小,故不能使用固定步骤。
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