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大鼠端粒酶活性实时定量PCR法检测试剂盒图片
产品货号:
KFS310
中文名称:
大鼠端粒酶活性实时定量PCR法检测试剂盒
英文名称:
Rat Telomerase Activity SYBR Green Real-time qPCR Kit
产品规格:
20T|50T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价

本试剂盒可以准确简便地进行mRNA的表达分析,采用的SYBR qPCR Master Mix为荧光实时定量PCR和Two-Step荧光实时定量PCR设计的最优反应体系,并结合特异性的细胞端粒酶催化亚基基因TERT引物,简化实验步骤和提高实验效率。Master Mix含有Maxima Hot Start Taq DNA聚合酶、dNTPS、进行优化处理的PCR反应缓冲液以及SYBR Green染料。使用Hot Start Taq DNA聚合酶,为PCR反应提供了更高的产量和灵敏度、特异性,能够检测低至10个拷贝的目的基因。


本试剂盒可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对细胞基因进行准确定量、检测,重复性好,可信度高。只需加入样品DNA模板,反应即可进行。




端粒是真核生物染色体末端特殊的DNA-蛋白结构,含多个重复序列(5'-TTAGGG-3'),端粒结构的形成和功能的维持需要端粒结合蛋白的直接或间接参与。端粒酶是细胞体内一种核糖核蛋白复合体,是由RNA和蛋白质亚基组成的一种特殊的逆转录酶,其可以利用自身的RNA模板合成末端DNA,并添加到染色体末端以克服末端序列的丢失,从而使细胞获得增殖能力。


端粒酶蛋白催化亚基(TERT或TRT)具有反转录酶的主要特征,其表达在正常细胞中受到抑制,研究表明,TERT或TRT的表达与端粒酶活性的表达一致,与端粒酶的活化程度密切相关。Wisman等在人卵巢癌中利用逆转录PCR检测hTERT的mRNA的表达,并采用TRAP法检测端粒酶活性,结果证实二者均存在于恶性肿瘤中并且表达模式相同。基于上述原理,百奥莱博实时荧光定量PCR端粒酶检测试剂盒通过检测TERT的mRNA表达水平来间接反应端粒酶的活性。




组分20T50T
2×Maxima SYBR qPCR Mix250μL700μL
Nuclease-free Water1.3mL1.8mL
GAPDH-F Primer(1OD)1支1支
GAPDH-R Primer(1OD)1支1支
TERT-F Primer(1OD)1支1支
TERT-R Primer(1OD)1支1支

保存:-20℃,避光,有效期1年。


为确保引物的稳定性,本品以干粉的形式提供,规格为1OD。临用前,请将每支引物分别用25μL Nuclease-free Water或自备的DEPC水溶解成100μM的储液。然后根据实验需要,取适量100μM储液稀释成10μM的工作液,再取适量稀释后引物加入到反应体系中。100μM引物储液置于- 20℃至少保存6个月。


适应于大多数的Real-time PCR扩增仪,包括Applied Biosystems,Eppendorf,Corbett,Bio-Rad,Roche,杭州博日(Line-GeneBioer)等品牌的PCR扩增仪。


  1. 模板
    1. DNA:25μL的Maxima SYBR Green实验体系中的基因组以及质粒DNA浓度最多为500ng。
    2. RNA:实时定量PCR体系中的RNA模板要求RNA模板没有基因组DNA的污染,我们建议使用DNase I来消除痕量的基因组DNA的污染;在实验体系中,最多5μg的总RNA用于cDNA的反转录合成,经反转录完毕后的cDNA模板总体系不应该超过实时定量PCR总体系的10%。
  2. 必要的实验控制
    1. 阴性对照(NTC):No template control反应是加入除模板DNA以外所有成分的阴性对照,可以避免或检测试剂中是否存在基因组DNA的污染、引物二聚体的产生。
    2. 阴性对照(RT Minus):Reverse Transcriptase Minus control反应是指加入除逆转录酶制剂以外的全部组分,可以来检测RNA样本中是否含有基因组DNA的污染。



  1. 操作步骤:
    1. 提取样本RNA,并进行逆转录获得cDNA。
      注:百奥莱博可提供总RNA提取试剂(Trizol法,货号:KFS435)
    2. 试剂溶解后,轻轻混匀并低速离心。
    3. 进行25μL体系的实时定量PCR请参考以下表格(DNA模板下一步中添加):
      成分用量
      2×Maxima SYBR qPCR Mix12.5μL
      TERT-F/TERT-R Primer(10μM)0.6~0.8μM
      GAPDH-F/GAPDH-R Primer(10μM)0.6~0.8μM
      Template DNA﹤500ng
      Nuclease-free Water至25μL
      注:
      ① 体系中含有的MgCl2终浓度为2.5mM。
      ② 大多数体系中引物终浓度为0.3μM可得到好的实验结果,如有调整,建议引物的终浓度范围在0.05~0.9μM。
      ③ 体系特殊要求,可以按照该体系进行调整。
    4. 将以上各组分(除DNA模板外)添加并混匀,加入至PCR反应管或反应板中。
    5. 添加DNA模板(≦500ng/反应)到第3步骤中准备好的PCR反应管或PCR板中。
      注:在两步法实时定量PCR中,加入的cDNA模板的体积不能超过反应总体积的10%。
    6. 轻轻的混匀PCR管中的各组分,避免产生气泡,如需要,可进行低速离心。如果有气泡的存在会影响荧光强度的收集。
    7. 参照一下说明设置实时定量PCR循环仪,放入样品并启动程序。(如有需要,可以根据仪器本身特点进行调整)
  2. 循环参数设置:
    循环反应可以采用三步法或两步法进行实验,参考数据如下:
    1. 三步法循环参数设置:
      阶段温度时间循环数
      (可选)UDG预处理50℃2min1
      总变性95℃10min1
      变性95℃15s40
      复性60℃30s
      延伸72℃30s
      注:荧光信号的收集和处理是在延伸阶段。
    2. 两步法循环参数设置
      阶段温度时间循环数
      (可选)UDG预处理50℃2min1
      总变性95℃10min1
      变性95℃15s 40
      复性/延伸60℃60s
  3. 可选步骤:
    1. UDG预处理:如需减少PCR产物的污染,可以于总变性前用UDG预处理2min。
    2. 熔解曲线分析:可用于验证引物设计的特异性以及鉴定PCR产物。如果引物设计不够优化,可能会产生部分的引物二聚体,这些引物二聚体可以通过熔解曲线观测到。
  4. 备注:
    1. 建议采用25μL的实验体系,如果改变请参照其余说明进行调整。
    2. 2×Maxima SYBR qPCR Mix含有除模板、引物外的全部组分,避免其反复冻融和污染是进行一个成功实时定量PCR反应的重要步骤。
    3. PCR扩增仪设定时需要建立起始5分钟,95℃的变性程序,以激活Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase。
    4. 一般实时定量实验中采用适宜体系确保2×Maxima SYBR qPCR Mix的最小化,避免产生大量的荧光强度。
    5. 针对不同实验条件和仪器型号重新调整荧光阈值。
    6. 当使用Bio-Rad的iCycler iQ或MyiQ system时请按照仪器生产商的说明进行实验。



问题可能原因以及解决方案
没有扩增曲线或琼脂糖电泳检测不到目的条带
  1. RNase污染
    1. 重新提取纯化RNA,分离无污染,高质量的RNA;
    2. 提取RNA的材料要尽量新鲜,防止RNA降解;
    3. 逆转录反应前,在变性胶上分析RNA的完整性;
    4. 有多聚糖的污染,用氯化锂的方法去除多聚糖。
  2. RNA中包含逆转录反应的抑制剂
    在提取RNA的过程中带有逆转录反应的抑制剂,通过70%乙醇对RNA沉淀进行清洗,除去抑制剂。逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,亚精胺,甲酰胺和胍盐等。
  3. 目标mRNA含有较强的转录中止子
    逆转录反应可用随机引物代替Oligo dT,适当提高逆转录反应的温度。
  4. 起始RNA量较少
    增加RNA的量。对于小于50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg~0.5μg乙酰BSA。
  5. 目的序列在分析的组织中不表达
    尝试其他组织。
  6. PCR反应中加入的逆转录产物过量
    PCR反应中加入的逆转录反应产物的体积不要超过总反应体积的10%。
  7. 引物发生降解
    对引物降解进行分析。
  8. 加样错误或者没有添加某一组分
    1. 重新进行实验,确认添加模板或引物的浓度;
    2. 确认试剂存放的温度条件,注意加样完全。
  9. UDG预处理的条件下,复性温度过低
    进过UDG处理后,PCR反应的复性温度应该高于55℃,如果复性温度必须要低于55℃,建议采用Heat-labile UDG。
没有扩增曲线
  1. 实时荧光定量PCR仪器设置错误
    检测仪器检测参数是否正确(荧光染料的选择,荧光检测参数的设置等)。
  2. 没有激活荧光检测装置
    激活荧光检测装置,设置于复性/延伸阶段或者延伸阶段收集荧光信号。
  3. PCR仪器错误
    参考仪器说明书解决仪器问题。
扩增曲线混乱或琼脂糖电泳检测到非特异条带
  1. 基因特异性引物设计较差
    重新设计合成引物,遵循用于扩增引物设计的同样原则。
  2. RNA中有基因组DNA的污染
    使用扩增级DNaseⅠ处理RNA;设置没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
  3. 镁离子浓度太高
    对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
  4. 引物和模板的非特异性退火
    1. 避免引物3'端含有2~3个dG或dC;
    2. 在第一链合成中使用基因特异性引物,而不是随机引物或oligo(dT);
    3. 在开始几个循环使用较高的退火温度,然后使用较低的退火温度。
无模板阴性对照获得扩增曲线或琼脂糖电泳检测到目的条带1.试剂中存在DNA污染
参考常规消除DNA污染的方法对模板进行处理,更换新的PCR试剂。
PCR效率超过110%
  1. 扩增出非特异性产物
    使用熔解曲线对PCR产物分析,鉴定PCR产物的特异性,重新纯化DNA模板
PCR效率低于90%
  1. 体系中存在PCR抑制剂
    重新纯化DNA模板。
  2. PCR反应条件不合适
    确认试剂的存放条件,确认引物浓度。
扩增曲线不佳
  1. DNA模板的浓度过大
    建议25μL的反应体系中DNA的最大量为500ng。
  2. 模板质量较差
    如果可能,提高DNA模板的质量。
  3. 添加的逆转录反应产物过量导致抑制作用
    实时定量PCR中加入的逆转录反应产物的体积不要超过总反应体积的10%。
荧光强度不一致(重复性较差)
  1. 实时荧光定量PCR循环仪存在污染
    根据仪器厂商说明清理仪器,减少影响实验的污染因素。
  2. PCR循环仪校准较差
    根据仪器厂商说明调整仪器。

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