产品货号:
KFS310
中文名称:
大鼠端粒酶活性实时定量PCR法检测试剂盒
英文名称:
Rat Telomerase Activity SYBR Green Real-time qPCR Kit
产品规格:
20T|50T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒可以准确简便地进行mRNA的表达分析,采用的SYBR qPCR Master Mix为荧光实时定量PCR和Two-Step荧光实时定量PCR设计的最优反应体系,并结合特异性的细胞端粒酶催化亚基基因TERT引物,简化实验步骤和提高实验效率。Master Mix含有Maxima Hot Start Taq DNA聚合酶、dNTPS、进行优化处理的PCR反应缓冲液以及SYBR Green染料。使用Hot Start Taq DNA聚合酶,为PCR反应提供了更高的产量和灵敏度、特异性,能够检测低至10个拷贝的目的基因。
本试剂盒可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对细胞基因进行准确定量、检测,重复性好,可信度高。只需加入样品DNA模板,反应即可进行。
端粒是真核生物染色体末端特殊的DNA-蛋白结构,含多个重复序列(5'-TTAGGG-3'),端粒结构的形成和功能的维持需要端粒结合蛋白的直接或间接参与。端粒酶是细胞体内一种核糖核蛋白复合体,是由RNA和蛋白质亚基组成的一种特殊的逆转录酶,其可以利用自身的RNA模板合成末端DNA,并添加到染色体末端以克服末端序列的丢失,从而使细胞获得增殖能力。
端粒酶蛋白催化亚基(TERT或TRT)具有反转录酶的主要特征,其表达在正常细胞中受到抑制,研究表明,TERT或TRT的表达与端粒酶活性的表达一致,与端粒酶的活化程度密切相关。Wisman等在人卵巢癌中利用逆转录PCR检测hTERT的mRNA的表达,并采用TRAP法检测端粒酶活性,结果证实二者均存在于恶性肿瘤中并且表达模式相同。基于上述原理,百奥莱博实时荧光定量PCR端粒酶检测试剂盒通过检测TERT的mRNA表达水平来间接反应端粒酶的活性。
组分 | 20T | 50T |
2×Maxima SYBR qPCR Mix | 250μL | 700μL |
Nuclease-free Water | 1.3mL | 1.8mL |
GAPDH-F Primer(1OD) | 1支 | 1支 |
GAPDH-R Primer(1OD) | 1支 | 1支 |
TERT-F Primer(1OD) | 1支 | 1支 |
TERT-R Primer(1OD) | 1支 | 1支 |
保存:-20℃,避光,有效期1年。
为确保引物的稳定性,本品以干粉的形式提供,规格为1OD。临用前,请将每支引物分别用25μL Nuclease-free Water或自备的DEPC水溶解成100μM的储液。然后根据实验需要,取适量100μM储液稀释成10μM的工作液,再取适量稀释后引物加入到反应体系中。100μM引物储液置于- 20℃至少保存6个月。
适应于大多数的Real-time PCR扩增仪,包括Applied Biosystems,Eppendorf,Corbett,Bio-Rad,Roche,杭州博日(Line-GeneBioer)等品牌的PCR扩增仪。
- 模板
- DNA:25μL的Maxima SYBR Green实验体系中的基因组以及质粒DNA浓度最多为500ng。
- RNA:实时定量PCR体系中的RNA模板要求RNA模板没有基因组DNA的污染,我们建议使用DNase I来消除痕量的基因组DNA的污染;在实验体系中,最多5μg的总RNA用于cDNA的反转录合成,经反转录完毕后的cDNA模板总体系不应该超过实时定量PCR总体系的10%。
- DNA:25μL的Maxima SYBR Green实验体系中的基因组以及质粒DNA浓度最多为500ng。
- 必要的实验控制
- 阴性对照(NTC):No template control反应是加入除模板DNA以外所有成分的阴性对照,可以避免或检测试剂中是否存在基因组DNA的污染、引物二聚体的产生。
- 阴性对照(RT Minus):Reverse Transcriptase Minus control反应是指加入除逆转录酶制剂以外的全部组分,可以来检测RNA样本中是否含有基因组DNA的污染。
- 阴性对照(NTC):No template control反应是加入除模板DNA以外所有成分的阴性对照,可以避免或检测试剂中是否存在基因组DNA的污染、引物二聚体的产生。
- 操作步骤:
- 提取样本RNA,并进行逆转录获得cDNA。
注:百奥莱博可提供总RNA提取试剂(Trizol法,货号:KFS435) - 试剂溶解后,轻轻混匀并低速离心。
- 进行25μL体系的实时定量PCR请参考以下表格(DNA模板下一步中添加):
注:成分 用量 2×Maxima SYBR qPCR Mix 12.5μL TERT-F/TERT-R Primer(10μM) 0.6~0.8μM GAPDH-F/GAPDH-R Primer(10μM) 0.6~0.8μM Template DNA ﹤500ng Nuclease-free Water 至25μL
① 体系中含有的MgCl2终浓度为2.5mM。
② 大多数体系中引物终浓度为0.3μM可得到好的实验结果,如有调整,建议引物的终浓度范围在0.05~0.9μM。
③ 体系特殊要求,可以按照该体系进行调整。 - 将以上各组分(除DNA模板外)添加并混匀,加入至PCR反应管或反应板中。
- 添加DNA模板(≦500ng/反应)到第3步骤中准备好的PCR反应管或PCR板中。
注:在两步法实时定量PCR中,加入的cDNA模板的体积不能超过反应总体积的10%。 - 轻轻的混匀PCR管中的各组分,避免产生气泡,如需要,可进行低速离心。如果有气泡的存在会影响荧光强度的收集。
- 参照一下说明设置实时定量PCR循环仪,放入样品并启动程序。(如有需要,可以根据仪器本身特点进行调整)
- 提取样本RNA,并进行逆转录获得cDNA。
- 循环参数设置:
循环反应可以采用三步法或两步法进行实验,参考数据如下:- 三步法循环参数设置:
注:荧光信号的收集和处理是在延伸阶段。阶段 温度 时间 循环数 (可选)UDG预处理 50℃ 2min 1 总变性 95℃ 10min 1 变性 95℃ 15s 40 复性 60℃ 30s 延伸 72℃ 30s - 两步法循环参数设置
阶段 温度 时间 循环数 (可选)UDG预处理 50℃ 2min 1 总变性 95℃ 10min 1 变性 95℃ 15s 40 复性/延伸 60℃ 60s
- 三步法循环参数设置:
- 可选步骤:
- UDG预处理:如需减少PCR产物的污染,可以于总变性前用UDG预处理2min。
- 熔解曲线分析:可用于验证引物设计的特异性以及鉴定PCR产物。如果引物设计不够优化,可能会产生部分的引物二聚体,这些引物二聚体可以通过熔解曲线观测到。
- UDG预处理:如需减少PCR产物的污染,可以于总变性前用UDG预处理2min。
- 备注:
- 建议采用25μL的实验体系,如果改变请参照其余说明进行调整。
- 2×Maxima SYBR qPCR Mix含有除模板、引物外的全部组分,避免其反复冻融和污染是进行一个成功实时定量PCR反应的重要步骤。
- PCR扩增仪设定时需要建立起始5分钟,95℃的变性程序,以激活Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase。
- 一般实时定量实验中采用适宜体系确保2×Maxima SYBR qPCR Mix的最小化,避免产生大量的荧光强度。
- 针对不同实验条件和仪器型号重新调整荧光阈值。
- 当使用Bio-Rad的iCycler iQ或MyiQ system时请按照仪器生产商的说明进行实验。
- 建议采用25μL的实验体系,如果改变请参照其余说明进行调整。
问题 | 可能原因以及解决方案 |
没有扩增曲线或琼脂糖电泳检测不到目的条带 |
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没有扩增曲线 |
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扩增曲线混乱或琼脂糖电泳检测到非特异条带 |
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无模板阴性对照获得扩增曲线或琼脂糖电泳检测到目的条带 | 1.试剂中存在DNA污染 参考常规消除DNA污染的方法对模板进行处理,更换新的PCR试剂。 |
PCR效率超过110% |
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PCR效率低于90% |
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扩增曲线不佳 |
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荧光强度不一致(重复性较差) |
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