产品货号：
KFS096
中文名称：
蛋白提取及SDS-PAGE电泳试剂盒
英文名称：
产品规格：
25T
发货周期：
1～3天
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本试剂盒可用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取全蛋白，用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液Lysis Buffer匀浆裂解组织或细胞，作用温和，提取过程简便高效。获得的全蛋白可用于Western Blot、免疫共沉淀等后续研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究，因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂。SDS-PAGE凝胶配快速制试剂提供了配制SDS-PAGE凝胶所需的各种试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水，即可配制PAGE凝胶。本试剂盒约可提取25个样品蛋白，约可配制20块常规大小的PAGE胶(即聚丙烯酰胺凝胶)。
| 包装 | 组分 | 规格 | 保存条件 |
| A盒 | Lysis Buffer | 25mL | 4℃ |
| 磷酸酶抑制剂 | 130μL | -20℃ | |
| 蛋白酶抑制剂 | 25μL | ||
| PMSF(100mM) | 250μL | ||
| B盒 | 30% Acr-Bis(29:1) | 50mL | 4℃，避光 |
| 1×Tris-HCl,pH8.8 | 50mL | 4℃ | |
| 1×Tris-HCl,pH6.8 | 8mL | ||
| 10% SDS | 3mL | 室温 | |
| 过硫酸铵 | 0.5g | 4℃ | |
| TEMED替代物 | 300μL |
保存：-20℃，有效期1年。
- 所有接触样品的用具及试剂均需预冷。
- 提取蛋白后，如有必要，可透析除去表面活性剂。
- TEMED替代物使用后请盖紧瓶盖，并保证避光保存。另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切，可通过适当调节TEMED替代物的用量(加倍使用可以节省1/3左右的时间，建议凝胶时间保证在30min以上，有助于SDS-PAGE检测的效果)，控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
- 蛋白提取
- 实体组织蛋白的提取
- 在每1mL冷Lysis Buffer加入5μL磷酸酶抑制剂，1μL蛋白酶抑制剂和5μL 100mM PMSF，混匀。冰上保存数分钟待用。
- 每100mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入0.5～1mL冷Lysis Buffer，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作；
- 取组织匀浆液转移到1.5mL预冷的离心管，离心14000转/分，4℃离心15min；
- 取上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物，蛋白定量(Bradford法、BCA法)；
- 分装保存于-70,℃避免反复冻融。
- 在每1mL冷Lysis Buffer加入5μL磷酸酶抑制剂，1μL蛋白酶抑制剂和5μL 100mM PMSF，混匀。冰上保存数分钟待用。
- 培养细胞蛋白提取
- 贴壁培养的细胞，吸去培养基后，加入10mL/150mm培养板的冷PBS洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液；
- 悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞，将细胞及培养液移至离心管中，1000转/分离心10min，再用10mL/150mm培养板的冷PBS，1000转/分离心5min洗两次；
- 在每1mL冷Lysis Buffer加入5μL磷酸酶抑制剂，1μL蛋白酶抑制剂和5μL 100mM PMSF，混匀。冰上保存数分钟待用。
- 细胞洗涤后，转至新的预冷的离心管中，加入上述配制好的冷Lysis Buffer，加入量如下表所示：
细胞数量 培养板或培养瓶的规格 Lysis Buffer加入量 107个 100mm培养板或150cm2培养瓶 1～2mL 5×106个 60mm培养板或75cm2培养瓶 0.5～1mL - 置于4℃摇床平台上，剧烈振荡30s，放置冰上4分钟，重复5次；
- 14000rpm，4℃离心15min，取上清为全蛋白提取物，蛋白定量(Bradford法、BCA法)；
- 分装保存于-70℃避免反复冻融。
- 贴壁培养的细胞，吸去培养基后，加入10mL/150mm培养板的冷PBS洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液；
- 实体组织蛋白的提取
- 凝胶配制
- 根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围：
SDS-PAGE分离胶浓度 最佳分离范围 6%胶 50～150kD 8%胶 30～90kD 10%胶 20～80kD 12%胶 12～60kD 15%胶 10～40kD - 按照如下表格配制SDS-PAGE的分离胶：
成分 配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升) 6%胶 5 10 15 20 30 50 蒸馏水 2.595 5.19 7.785 10.38 15.57 25.96 30% Acr-Bis 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 10.0 1.5M Tris-HCl,pH8.8 1.3 2.6 3.9 5.2 7.8 13 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED替代物 0.005 0.01 0.015 0.02 0.03 0.04 成分 配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升) 8%胶 5 10 15 20 30 50 蒸馏水 2.295 4.69 7.085 9.48 14.17 23.66 30% Acr-Bis 1.3 2.6 3.9 5.2 7.8 13 1.5M Tris-HCl,pH8.8 1.3 2.6 3.9 5.2 7.8 13 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED替代物 0.005 0.01 0.015 0.02 0.03 0.04 成分 配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升) 10%胶 5 10 15 20 30 50 蒸馏水 1.895 3.79 5.685 7.58 11.37 18.96 30% Acr-Bis 1.7 3.4 5.1 6.8 10.2 17.0 1.5M Tris-HCl,pH8.8 1.3 2.6 3.9 5.2 7.8 13 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED替代物 0.005 0.01 0.015 0.02 0.03 0.04 成分 配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升) 12%胶 5 10 15 20 30 50 蒸馏水 1.595 3.19 4.785 6.38 9.57 15.96 30% Acr-Bis 2.0 4.0 6.0 8.0 12.0 20.0 1.5M Tris-HCl,pH8.8 1.3 2.6 3.9 5.2 7.8 13 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED替代物 0.005 0.01 0.015 0.02 0.03 0.04 成分 配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升) 15%胶 5 10 15 20 30 50 蒸馏水 1.095 2.19 3.285 4.38 6.57 10.96 30% Acr-Bis 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 25.0 1.5M Tris-HCl,pH8.8 1.3 2.6 3.9 5.2 7.8 13 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED替代物 0.005 0.01 0.015 0.02 0.03 0.04 - 按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)
成分 配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升) 5%胶 2 3 4 6 8 10 蒸馏水 1.371 2.054 2.742 4.108 5.484 6.85 30% Acr-Bis 0.332 0.498 0.664 0.996 1.328 1.66 1.0M Tris-HCl,pH6.8 0.252 0.378 0.504 0.756 1.008 1.26 10% SDS 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1 10%过硫酸铵 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1 TEMED替代物 0.005 0.01 0.01 0.02 0.02 0.03
- 根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围：
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