His标签蛋白纯化试剂盒(超声裂解)

产品货号：

KD1340

中文名称：

His标签蛋白纯化试剂盒(超声裂解)

英文名称：

His-Tag Protein purification Kit I

产品规格：

10T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本试剂盒是基于Ni亲和层析的蛋白质纯化方法进行His标签蛋白纯化的试剂盒；变性和非变性条件均可使用，也适用于纯化包涵体中的His标记蛋白。最大载量为20～30mg His标记蛋白质/mL介质。本试剂盒可满足10次His蛋白纯化(50mL体积的细菌)。

组分	规格	保存
Ni-Agarose介质(50%)	5mL	2～8℃
洗涤液	125mL
超声裂解缓冲液	30mL
包涵体变性洗涤液	125mL
1M咪唑溶液	50mL	RT
1M Tris-HCl溶液(pH7.9)	30mL
5M NaCl溶液	30mL
尿素	15g
层析柱(6mL)	10个
PMSF溶剂	1mL
PMSF干粉	100mg

保存：2～8℃，有效期1年，不可冻存！

实验准备：
第一次使用时把一管PMSF溶剂加入PMSF干粉中，震荡溶解，即配制成PMSF(10mg/mL)溶液。配成PMSF溶液后需-20℃保存。

操作步骤：

一、装柱

将Ni-Agarose介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中。
注意：介质用量需要根据His蛋白产量决定，请根据实验需要取适量的Ni-Agarose介质加入层析柱。
用5倍柱体积(指填料的体积，下同)自备去离子水洗柱，共三次。
用5倍柱体积的洗涤液洗柱，共三次。
室温5000g离心10min收集50mL表达菌液，弃上清，沉淀放冰上待用或放-80℃保存。最好用不加诱导物的菌液做对照。
注意：以下成分均以50mL菌液计算用量，实际用量可根据菌体量增减。

二、裂解
超声破碎细菌：加入2.5mL冰浴的超声裂解缓冲液，再加入60μL PMSF(10mg/mL)溶液，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。

三、纯化

纯化可溶性His标记蛋白
- 将上步得到的上清液上柱，用层析柱的底端的盖子盖上，让细菌裂解液和介质在4℃结合0.5-12h后取掉盖子，自然重力下让裂解液自然流出。
- 用10倍柱体积洗涤液洗柱，收集并保存穿透液(含杂质或没被吸附的His标记蛋白，可做SDS-PAGE电泳的对照)。
- 按下表配置含不同浓度咪唑的洗脱液，以确定His标签蛋白的最适洗涤液的咪唑浓度。按从低到高的顺序洗涤并收集样品，SDS-PAGE电泳检测His标记蛋白所在的区域。
  注意：建议咪唑浓度梯度为：40、70、100、200、300、400、500mM。
- 如已知咪唑洗脱浓度，可直接配置该浓度的洗脱液进行洗脱。
- 洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，最后堵住层析柱下端的漏口，4℃保存待下次使用。
纯化包涵体中His标记蛋白
- 将包涵体沉淀重悬于2mL包涵体变性洗涤液。冰浴1h以使包涵体溶解，期间可轻柔摇晃几次。
- 室温10000g离心20min，沉淀为未溶解的包涵体。将上清(含溶解后的His标记蛋白)以自备的针头过滤器(0.45μm)过滤。
- 将滤过液上柱，用层析柱底端的盖子盖上，让细菌裂解液和介质在4℃结合0.5-12h后取掉盖子，自然重力下让裂解液自然流出。
- 用10倍柱体积包涵体变性洗涤液洗柱，收集并保存穿透液(含杂质或没被吸附的His标记蛋白，可做SDS-PAGE电泳的对照)。
- 按下表配置含不同浓度咪唑的变性洗脱液，以确定His标签蛋白的最适洗涤液的咪唑浓度。按从低到高的顺序洗涤并收集样品，SDS-PAGE电泳检测His标记蛋白所在的区域。
纯化已复性的包涵体蛋白
- 将可溶性蛋白溶液，按照纯化细胞裂解液中可溶性His标记蛋白操作。

四、再生(自备试剂)
纯化相同的蛋白质可以纯化5～7次后再进行再生，再生的凝胶最好用于相同蛋白的纯化。凝胶最多再生3～4次，一次或多次再生后，凝胶的蛋白结合能力会有所下降，并且非特异性结合也会升高。具体步骤如下：

5倍柱体积的去离子水洗柱一次。
1倍柱体积的25%、50%、75%乙醇各洗柱一次。
5倍柱体积的100%乙醇洗柱一次。
1倍柱体积的75%、50%、25%乙醇各洗柱一次。
2倍柱体积的去离子水洗柱一次。
2倍柱体积的200mM EDTA (pH8.0)，洗柱一次。
5倍柱体积的去离子水洗柱一次。
3倍柱体积的50mM NiSO4洗柱一次。
3倍柱体积的非变性裂解液洗柱一次。
加入3倍柱体积的去离子水洗柱一次。
随后把凝胶存放在20%乙醇中，4℃保存。

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