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产品说明：
本产品基于匀浆裂解出叶绿体粗提物，后经密度梯度离心纯化出完整高纯叶绿体。
纯化出来的叶绿体可用于后续的光合作用，电子链和磷酸化，跨膜转运，体外叶绿体蛋白合成，蛋白定位等研究。还可用于的叶绿体膜，基质，类囊体，叶绿体DNA和叶绿体RNA纯化。
本产品提供纯化15次的试剂量。每次处理叶片量约为30g。
产品组成：
注意事项：
叶绿体对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用器皿和溶液均需要在4℃预冷。离心时一定要在4℃进行，离心力以g而不是rpm计算。为避免叶绿体活性降低，尽量在1h内完成实验。如果需要研究叶绿体的功能，提取过程还需要在昏暗的光线条件下进行。
使用方法：
(一)试剂准备：
1.匀浆液：将自备的去离子水与5×匀浆液按4：1的比例混合，然后在混合液中加入BSA到终浓度0.1%(每100mL中加入0.1g BSA)，摇晃溶解后所得溶液即为匀浆液，冰上预冷待用。一次实验(从30g叶片提取叶绿体)所需要的匀浆液体积根据材料不同而不同。
2.1×重悬液：将自备的去离子水与5×重悬液按4：1 (16mL+4mL)的比例混合。每次实验准备20mL的1×重悬液备用。
(二)匀浆裂解：
1.实验前1～2天将植物放在暗室培养以减少叶绿体中淀粉颗粒的形成，否则离心时这些颗粒很容易使叶绿体破裂。叶片在实验前需先用自来水洗净，再用蒸馏水淋洗，去掉多余水分。如果叶片采集后不能立即处理，则保存时需要保持叶片湿润，即使如此，叶片的放置时间也不能超过一天。
2.新鲜采集植物叶片，快速去除叶脉并将叶片剪成1-3cm2大小的碎片并浸泡在适量的预冷的匀浆液中(每克叶片加4mL匀浆液，但对烟草和大豆，每克叶片需要加6mL匀浆液)。
3.将浸泡了叶片的匀浆液转移到Waring匀浆机(即家用制备果汁的匀浆机)中，低速匀浆10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入匀浆机底部后，再低速匀浆10秒。
注意：除Waring匀浆机外，还可以选择Dounce玻璃匀浆器，Polytron匀浆机和研磨(加玻璃珠)等裂解细胞的方法，但这些方法的单次处理量都比较小，需要将样品分成很多小份单独匀浆，然后再汇集。
4.用Miracloth(millipore)过滤匀浆液，等分到4个预冷的50mL的塑料离心管中(每个管中的滤液不要超过35mL)。
5.在水平转子离心机上4℃ 200g离心3分钟(对菠菜，白菜和莴笋材料)或400g离心1分钟(对甜菜材料)，白色沉淀为未破裂的细胞或细胞核。
6.将上清液(含叶绿体)转移到一个新的、预冷的50mL塑料离心管中。
7.在水平转子离心机上4℃ 1300g离心7分钟，小心弃上清，沉淀含叶绿体，呈浅绿色。
8.在沉淀中加入1.5mL预冷的1×重悬液(配置方法)，手弹离心管底部使叶绿体重悬。
注意：重悬时最好避免溶液起泡，也不要用枪头吹打，否则叶绿体容易破裂。沉淀下有白色淀粉属于正常现象，但重悬叶绿体时避免将白色淀粉重悬。
9.将4管叶绿体重悬液汇集(共约6mL)。此溶液为叶绿体粗提产物，可直接用于后续的SDS-PAGE，Western，ELSIA和蛋白组分析。如果需要以之为材料精提叶绿体，就需要将破裂的叶绿体和完整的叶绿体分开，根据植物的不同，可选用下述两种密度梯度离心法之一进行分离。
(二)叶绿体纯化：
A：单浓度分离法(适合菠菜，白菜和莴笋等材料)：
1.在50mL塑料离心管中先加入2mL 5×重悬液、4mL percoll细胞分离液和4mL去离子水，充分混合均匀。
2.在其液面上小心铺上汇集得到的约6mL叶绿体重悬液。
3.在水平转子离心机上4℃ 1300g离心8分钟，最上层的绿色带含破碎的叶绿体，线粒体和核糖体等，管底的绿色沉淀为完整的叶绿体。
4.小心将上清倒出后，在叶绿体沉淀中加入预冷的0.5mL 1×重悬液，手指轻弹管底使之重悬。
5.将叶绿体重悬液转移到1.5mL离心管中并避光保存。可在相差显微镜下检查叶绿体完整性。叶绿体必须尽快使用，否则非常容易失去活性。
B：双浓度分离法(适合烟草，甜菜和大豆等材料)：
1.在14mL塑料离心管中加入0.5mL 5×重悬液和2mL percoll细胞分离液，充分混合均匀，得密度梯度重液。
2.在另一离心管中加入1mL 5×重悬液、2mL percoll细胞分离液和2mL去离子水充分混合均匀，得密度梯度轻液。
3.将密度梯度轻液小心铺在密度梯度重液之上，然后将第9步汇集得到的叶绿体重悬液中的4mL(还剩2mL，可以重复一次或备用)小心铺在密度梯度轻液之上。
4.在水平转子离心机上4℃ 3750g离心15分钟，最上层绿色带含破碎的叶绿体、线粒体和核糖体等，重液和轻液间的绿色带为完整叶绿体。
5.用广口吸管小心将重液和轻液之间的绿色带(叶绿体)转移到新的离心管中，加入三倍体积的预冷的1×重悬液，轻柔混匀。
6.在水平转子离心机上4℃ 1700g离心1分钟，小心将上清倒出后，在绿色的叶绿体沉淀中加入预冷的0.5mL 1×重悬液，手指轻弹管底使之叶绿体重悬。
7.将叶绿体重悬液转移到1.5mL离心管中并避光保存，也可在相差显微镜下检查叶绿体完整性。叶绿体必须尽快使用，否则非常容易失去活性。所得精提叶绿体可用于后续的光合作用，电子链和磷酸化，跨膜转运，体外叶绿体蛋白合成，蛋白定位等研究。还可用于的叶绿体膜，基质，类囊体，叶绿体DNA和叶绿体RNA纯化。
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