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本试剂盒试剂盒采用挤出法进行低浓度蛋白溶液浓缩，通过空间排斥机制使蛋白质从水相中聚集析出，提取剂在溶液中形成网状结构，降低蛋白质水化层厚度，促使蛋白凝聚析出。适用于从各种含蛋白质的液体样本中浓缩蛋白，包括但不限于各种低浓度蛋白质溶液、细胞培养上清、细菌、酵母培养上清、脑脊液、尿液等液体样品。提取过程简单方便，可在1小时内完成。

本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用组织细胞总蛋白提取试剂盒(2D电泳用)。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用蛋白脱盐柱脱盐处理。

本试剂盒方法条件温和，沉淀可逆，对蛋白活性影响极小。提取得到的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

• 条件温和，不易导致蛋白质变性，适合活性蛋白处理.
  
• 操作简便，设备要求低（仅需离心机）。
  
• 可同时实现蛋白质浓缩与初步纯化。
  
• 使用方便，将蛋白提取的时间缩短至1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 重复性高。

• 试剂准备：蛋白定量试剂
  
• 仪器准备：离心机、振荡器、涡旋混匀器、移液器、冰箱、冰盒
  
• 耗材准备：离心管、吸头、一次性手套

• 有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期，试剂拆封后请尽快使用完。
  
• 预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM，r/min）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：g=r×1.118×10^-5×rpm² （r为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米)例如:转速为3000rpm，有效离心半径为10cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10^-5×3000²=1006.2（×g）。

• 将液体样本于4℃，5000～10000×g离心10～15分钟，取上清，去除细胞碎片、脂类等杂质。
  
• 在1000μL待浓缩液体蛋白样本中滴加或分5-10批次加入500μL预冷的提取试剂A，边加边轻轻吹打充分混匀或颠倒混匀。
  
  • 以1mL待浓缩样品为例，实际根据样品体积等比例调整试剂A使用量即可（例如800μL样品滴加400μL试剂A；600μL样品滴加300μL试剂A）。
    
  • 可以根据需要按比例加入预冷的蛋白酶抑制剂混合物（可选）。
• 在4℃条件下振荡30～60分钟。
  
  • 确保沉淀完全形成。
    
  • 少数特殊情况下，难析出蛋白（60min未见沉淀）可延长至2小时或4℃静置过夜（12～18小时）。
    
  • 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
    
  • 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
• 在4℃，10000×g条件下离心10～15分钟，使析出的蛋白质沉淀完全聚集于管底。
  
• 小心移除上层清液丢弃，留沉淀。
  
  • 尽可能吸干上清。
    
  • 避免吸掉蛋白沉淀，导致蛋白损失。
• 可选步骤：在沉淀中加入等体积的洗涤液B。4℃，8000×g离心1分钟，小心移除上层清液丢弃，留沉淀。
  
  • 洗涤后可提高蛋白纯度，但是会导致蛋白有少量损失（约5%）。仅在样品实在珍贵时，可省略洗涤步骤。一般建议洗涤，可以大幅度提高蛋白纯度。
    
  • 沿管壁缓慢加入沉淀体积1倍的预冷洗涤液B，不要吹打、不要涡旋，轻轻倾斜管子让液体流过沉淀，立即4℃离心1min，快速吸掉洗涤液。
    
  • 尽可能吸干上清。
    
  • 避免吸掉蛋白沉淀，导致蛋白损失。
• 加入原样本体积的1/20-1/5体积的溶解液C到沉淀（例如：1000μL浓缩前体积，加入50μL～200μL溶解液C），用移液器轻柔吹打或涡旋混合，使沉淀完全溶解。
  
  • 若复溶后仍有少量不溶物，可再次离心（10000×g，5分钟）取上清。
• 将蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  
  • 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。
    
  • 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
• 将蛋白样品透析处理或者脱盐柱脱盐处理后用于下游实验。
  
  • 蛋白样品中含有盐，需要脱盐处理后用于双向电泳。
    
  • 经透析或脱盐离心柱处理的蛋白样品不含有去垢剂和高浓度盐。

• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组分，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组分，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
  
• 其他常见问题与解决方案？
  

  问题	可能原因	解决方案
  无沉淀形成	提取液浓度不足； 蛋白浓度过低； 离子强度不适	提高提取液用量； 换柱法蛋白浓缩试剂盒； 调整缓冲液离子强度
  沉淀难复溶	沉淀过度； 蛋白变性； pH不适	降低提取液用量； 缩短孵育时间； 优化蛋白液pH
  蛋白活性丧失	温度过高； 搅拌剧烈； 沉淀时间过长	4℃操作； 轻柔混匀； 控制孵育时间≤2小时
  纯度低	非特异性共沉淀； 提取液浓度过高	优化提取液浓度； 增加洗涤步骤