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本试剂盒基于Lowry法蛋白定量，测定范围为20～2000μg/mL，在此范围内有较好的线性，最小检测蛋白量可达0.2μg，检测浓度下限达到10μg/mL。本试剂盒采用牛血清白蛋白（BSA）溶液作为蛋白质标准品溶液。

如需检测Lowry法背景值较高而不适合Lowry法的样品，可以选用BCA法蛋白定量试剂盒(货号：HR0329)或Bradford蛋白定量试剂盒(货号：HR0332)。

• 仪器准备：酶标仪或分光光度计、移液器、冰箱、冰盒
  
• 试剂准备：纯水、生理盐水
  
• 耗材准备：离心管、吸头、一次性手套、96孔板

• 试剂拆封后请尽快使用完！
  
• 蛋白标准(BSA)粉末溶解于蛋白标准配制液后，即获得蛋白标准原液，该原液中含有防腐剂，不影响后续检测，该蛋白标准原液-20℃长期保存，注意防止微生物污染，避免反复冻融。
  
• 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中，否者待测蛋白与蛋白标准中所含非蛋白成分不一致，有可能导致测定不准确。
  
• 如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色皿的最小检测体积。应按比例适当加大改良Lowry Reagent工作液的用量使总体积不小于最小检测体积，样品和标准品的用量亦相应按比例放大。使用分光光度计测定蛋白浓度时，每个试剂盒可以测定的样品数量会显著减少。
  
• 建议所以样品(包括标准品)采用三复孔，求平均值。

• 试剂配制：
  
  • Folin-Ciocalteu Reagen工作液配制：
    根据样品数量，按Folin-Ciocalteu Reagent:纯水=1：1的比例配制Folin-Ciocalteu工作液，充分混匀。
    
  • Lowry工作液配制：
    临用前，根据样品数量，按Lowry B1:B2:B3=50:1:1比例配制改良Lowry Reagent工作液，即配即用。
    总Lowry工作液体积=（标准品+待测样品）×每个样品所需要的Lowry工作液×重复数
    
  • 蛋白标准工作液配制：
    取1mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准(BSA)(20mg)中，充分溶解后配制成20mg/mL的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，溶解后的蛋白标准溶液应-20℃保存。
    取适量20mg/mL蛋白标准，稀释至终浓度为1500μg/mL或所需浓度。如取75μL 20mg/mL蛋白标准，加入925μL稀释液，充分混匀，即配制成1500μg/mL蛋白标准。
• 蛋白检测：
  
  • 将1500μg/mL蛋白标准用稀释待测样品的溶液5倍梯度稀释，浓度分别为
    300μg/mL、60μg/mL、12μg/mL、2.4μg/mL、0μg/mL。
    
  • 各取40μL加到96孔板的标准品孔。
    
  • 加40μL待测蛋白样品或稀释液(空白对照)到96孔板的样品孔中，如果标准品稀释液与溶解待测蛋白样本的溶液不同，应在待测蛋白样本孔中加入40μL稀释液；如果标准品稀释液与溶解待测蛋白样本的溶液相同，无需在待测蛋白样本孔中加入40μL稀释液。
    
  • 用多通道微量移液器快速将200μL配制好的改良Lowry Reagent工作液加入至各孔，立即在96孔板混匀器上充分混匀或手动轻轻混匀30s。室温准确孵育10分钟。
    
  • 用多通道微量移液器快速将20μL新鲜配制的Folin-Ciocalteu工作液加至上述各孔中，立即在96孔板混匀器上混匀或手动轻轻混匀30s。加盖以防止液体挥发，室温准确孵育30分钟。
    
  • 轻轻混匀96孔板，酶标仪测定750nm处吸光度，
    
  • 对比标准曲线，求得相应待测样品的蛋白浓度。

• 是否每次测定时都需要做标准曲线？
  建议每次测定时都做标准曲线。因为Lowry法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则如需精确测定宜每次都做标准曲线。
  
• 测定时发现随着浓度的增加吸光度或颜色没有明显变化。
  可能的原因是样品中含有严重干扰Lowry法测定蛋白浓度的物质。
  
• 待测样品一定需要稀释吗？
  不一定。对于样本来说，需不需要稀释取决于样本的检测值是否落在标准曲线范围内，如果样本浓度超过试剂盒的最高的检测限，那么样本是需要稀释后检测的。