产品目录

本试剂盒适用于提取新鲜植物样本的叶绿体蛋白，用于冻存样本的提取时由于冻存过程中大部分叶绿体会被破坏，叶绿体蛋白回收率较低。本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解叶绿体膜组份。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒采用酶法提取，酶法提取制备的叶绿体，回收率提高，纯度高，但是耗时较长。非酶法的提取试剂盒提取过程简单方便，速度快，可在1小时内完成，而且绝少交叉污染，但是回收率相比酶法较低。如果需要更加快捷的提取试剂盒，可以选择非酶法的提取试剂盒(相关产品HR8058)，对提取速度没有要求的话，可以选择酶法提取试剂盒(相关产品HR8059)。请根据实际需要选择试剂盒。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。本试剂盒提取的蛋白可用于WB、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒的蛋白提取组份中不含有不可透析除去的去垢剂组份，不含SDS、Triton X-100、chaps等可能影响质谱实验的组份，最后得到的蛋白质样品经过透析或者脱盐处理后将不含有去垢剂、高浓度盐等影响，基本可以满足下游任意的蛋白质组学相关实验研究。

本产品的蛋白酶抑制剂混合物中不含AEBSF，可以避免由于AEBSF导致的质谱峰漂移，因此使用本产品提取的蛋白样品可以用于质谱检测和分析，蛋白质组学等相关研究。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

• 螺旋离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 实验过程中的所有实际需预冷，所有器具须放-20℃冰箱预冷，整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 如产品不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  
• 可以根据自己实验需要加入其他蛋白酶抑制剂单品。

• 提取液准备：
  将试剂C1和试剂C2混合，配成蛋白提取液C，充分混匀备用。
  每500μL蛋白提取液C中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  注：
  ● 蛋白提取液C置4℃保存，长期不用的可以分装后-20℃保存。
  ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未用完，再次用前需再次加入蛋白酶抑制剂。
  
• 取1g新鲜植物叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉。用手术剪刀尽可能剪碎。
  
• 加入2mL PBS用组织搅碎机/匀浆机/匀浆器充分匀浆。
  
• 将匀浆用100μm细胞筛过滤。
  注：
  ● 没有细胞筛的话，在4℃，稍微静置，让粗纤维，成团组织块等沉降，收集细胞上清，弃组织沉淀。
  ● 有些含黏液较多的样品可能难以吸取，可以将1mL吸头尖稍微剪掉一点使用。
  
• 将滤液在3000×g条件下离心10分钟，收集沉淀。
  
• 在沉淀中加入500μL提取液A，充分混匀。
  注：
  ● 培养细胞可以在1000g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞后用PBS洗涤2次，然后直接加入提取液A重悬。
  ● 大约每300μL细胞压积(沉淀体积)中加入1mL提取液A。
  
• 将悬液置振荡器上37℃或室温振荡12～72小时。
  注：
  ● 使用振荡器/摇床的较低转速，保证提取液能轻微晃动即可。
  ● 没有振荡条件也可以不振荡，中间每隔几小时用移液器吹打混匀即可。
  ● 根据下游叶绿体的应用选择合适的温度。最高可以至55℃，提高温度至55℃可以缩短试剂A处理时间。
  ● 不同类型的植物样本需要处理的时间差异较大。拟南芥较易处理，鲜嫩叶片较易处理，年龄小的样本处理时间短。
  ● 部分细胞壁较厚的植物类型可能需要处理更长时间。可以延长至72小时以上处理以提高叶绿体得率。
  
• 在3000×g条件下离心10分钟，弃上清，收集沉淀。
  
• 在沉淀中加入0.5mL提取液B，充分混匀。
  
• 置振荡器振荡20分钟。
  注：
  ● 使用振荡器/摇床的较低转速，保证提取液能轻微晃动即可。
  ● 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
  
• 在200×g力离心2分钟。弃沉淀，取上清。
  
• 在800×g力离心2分钟。弃沉淀，取上清。
  
• 将上清3000×g力离心10分钟。弃上清，收集沉淀。
  
• 在沉淀中加入100～400μL叶绿体蛋白提取液C，充分混匀。
  注：
  ● 每500μL蛋白提取液C加入2μL蛋白酶抑制剂混合物。
  
• 在4℃条件下振荡20～30分钟。
  注：
  ● 试剂C处理时间根据预实验结果调整。至叶绿体充分裂解，离心后无明显大量叶绿体沉淀。
  
• 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
  
• 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到叶绿体总蛋白。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
  ● 蛋白样品-80℃存放一年没问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
  
• 将样品透析处理或者脱盐处理后用于不能含有去污剂/盐的下游实验。
  注：
  ● 蛋白样品中含有盐，需要脱盐处理后用于双向电泳。
  ● 经透析或脱盐离心柱处理的蛋白样品不含有去垢剂和高浓度盐。

• 蛋白浓度低？
  处理部分样本可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。适当延长试剂C的处理时间即可。最好在持续振荡条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。