产品目录

本试剂盒采用酶法提取植物叶绿体膜蛋白，具有回收率高、提取蛋白纯度高、保持蛋白天然活性等特点。非酶法提取过程简单方便速度快，而且绝少交叉污染，但是回收率相比酶法较低，非酶法可选购植物叶绿体膜蛋白提取试剂盒(货号：HR0151)

叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的，由于具有这一重要功能，所以叶绿体一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器。跨膜蛋白承担各种生物功能，在生物的各种发展过程中扮演重要角色。膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析及质谱分析等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。


本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白，可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。本试剂盒中不含EDTA，与金属螯合层析等下游应用兼容。

本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请选用其他货号的产品，也可将最后样品除盐后再用于2D电泳，用蛋白脱盐柱(货号：HR0389)脱盐处理。

• 使用方便，从细胞、组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂（AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64）。每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

组分	50T	100T
试剂A：叶绿体提取液A	25mL	50mL
试剂B：叶绿体提取液B	100mL	200mL
试剂C：叶绿体提取液C	25mL	50mL
试剂D：膜蛋白溶解液D	10mL	20mL
试剂E：蛋白酶抑制剂混合物	100μL	200μL

保存：提取液2～8℃保存，蛋白酶抑制剂-20℃保存，有效期1年。

• 蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可2～8℃保存，开盖使用后-20℃保存。
  
• 试剂盒有效期是未开封前按要求条件保存的期限，试剂盒开启后应尽快用完。

• 仪器准备：离心机、振荡器、匀浆机、涡旋混匀器、移液器、冰箱、冰盒。
  
• 试剂准备：1×PBS缓冲液(pH7.4)、蛋白定量试剂盒。
  1×PBS缓冲液:8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl。
  
• 耗材准备：离心管、吸头、一次性手套。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 操作时必须按照下面步骤里的温度条件，否则严重影响膜蛋白的回收率。
  
• 提取液B在使用前须一直置于2～8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
  
• 膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。
  
• 膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。

• 提取液制备：
  
  • 每500μL冷的蛋白提取液C中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    
  • 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
    
  • 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要另外加入蛋白酶抑制剂。
    
  • 提取液C在使用前须一直置于2～8℃条件下，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
    
  • 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步骤配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
• 取500mg～1g新鲜植物叶片样本，用纯水洗净擦干后去除叶梗和粗脉，用手术剪刀或锋利的刀片剪切碎，切成0.5×0.5mm细块。
  
• 加入500μL提取液A，充分混匀。
  
• 将悬液置振荡器上室温振荡12～72小时。
  
  • 使用振荡器/摇床的较低转速，保证提取液能轻微晃动即可。
    
  • 没有振荡条件也可以不振荡，中间每隔几小时用移液器轻轻吹打混匀即可。
    
  • 不同类型的植物样本需要处理的时间差异较大：拟南芥较易处理，鲜嫩叶片较易处理，年龄小的样本处理时间短，部分细胞壁较厚得植物类型可能需要处理更长时间，可以延长至72小时以上处理以提高得率。
• 在1000×g条件下离心5～10分钟，弃上清，收集沉淀。
  
  • 有条件可以用100μm细胞筛网过滤提取液处理液后，收集滤液再离心；没有细胞筛可以不过滤。
• 在沉淀中加入2mL提取液B用组织搅碎机/匀浆机/Dounce匀浆器充分匀浆。
  
• 将匀浆用100μm细胞筛过滤。
  
  • 没有细胞筛时可以不过滤，将匀浆液静置1分钟，待大的没有破碎的组织块自然沉降，吸取上清。
    
  • 部分粘液较多的植物样本可能难以吸取，可以将1mL吸头的口剪掉一点再吸。
• 将滤液500×g力离心3分钟。将上清移入另一干净离心管。
  
• 将上清3000×g力离心10分钟。弃上清，收集沉淀。
  
• 在沉淀中加入500μL蛋白提取液C，充分混匀。在2～8℃条件下振荡1小时。
  
  • 此步骤必须保持低温条件下振荡。
    
  • 用振荡器/摇床的较低转速，保持液体稍微有晃动即可。
    
  • 没有低温振荡条件可以不振荡，在2～8℃静置，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
• 将提取液在4℃，12000×g条件下离心5分钟，取上清。
  
• 在37℃水浴10分钟。
  
• 在37℃，500～1000×g离心3分钟。
  
  • 此步骤必须37℃条件下离心。
    
  • 如果离心机不可控温，可以不离心，延长上一步水浴时间，至溶液分层清晰即可。或者在室温条件下离心，缩短离心时间至1分钟。
• 此时溶液分为两层，小心移除上层，保留下层溶液，大约30～50μL。
  
  • 下层为粘稠状液体。
    
  • 下层叶绿体膜蛋白为黄绿色。通常不影响下游应用。
• 用50～150μL冷的膜蛋白溶解液溶解下层溶液，即得叶绿体膜蛋白。
  
  • 膜蛋白比较难溶解，不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于4℃冰箱静置至溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀一次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。
    
  • 于4℃静置直至管底透明胶状物完全溶解。
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或调整相应的浓度后直接用于下游实验。
  
  • 建议用BCA法进行蛋白定量，可选择BCA法蛋白定量试剂盒(货号：HR0329)。
    
  • 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低？
  
  • 膜蛋白丰度比较低，需要足够的植物样品上样量才能提高蛋白浓度。在条件允许的情况下，请尽可能提高上样量。
    
  • 也可能第7步处理时，部分样本可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂C的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
    
  • 注意第3步处理组织样本要充分，在整个后续的离心过程中不要将叶绿体丢掉了，根据颜色及可判断。
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂中含有干扰Bradford法的组分，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组分，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
  
• 膜蛋白电泳没有条带？
  
  • 膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
    
  • 膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
    
  • 蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
    
  • 蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%～10%。
    
  • 有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
    
  • 电泳时最后采用低电压低电流电泳。
    
  • 膜蛋白丰度通常较低，有条件可以尝试用银染染色。

相关搜索：植物叶绿体膜蛋白提取试剂盒(酶法)，植物叶绿体膜蛋白提取