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本试剂盒利用磷酸基团与金属的亲和力，采用固定化金属螯合层析(IMAC)的方法富集磷酸化蛋白。可以选择性的对磷酸化蛋白和多肽进行富集和纯化。本试剂盒可以用来提取富集植物样本的的磷酸化蛋白。经本试剂盒制备的蛋白样品可用于WB,mass spectrometry,2D-PAGE和protein arrays等下游应用。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 蛋白样品中不可含EDTA。
  
• 每个柱的载量约为1mg磷酸化蛋白。
  
• 上样蛋白样品pH值必须低于6，蛋白浓度在0.25～0.5mg/mL。
  
• 洗涤细胞和组织时不能用PBS等磷酸盐缓冲液，要用非磷酸盐缓冲液，如50mM HEPES，Tris或生理盐水。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它磷酸酶抑制剂单品。
  
• 用蛋白柱进行磷酸化蛋白富集，需要离心操作时将蛋白柱置于一个50mL离心管离心即可。
  
• 最终蛋白样品用于2D电泳前需脱盐。

• 蛋白样品的准备：
  以下为由新鲜植物细胞和组织制备蛋白样品的参考步骤，其它方法得到的蛋白样品稀释至蛋白浓度为0.25～0.5mg/mL后直接上样即可，确保蛋白样品的pH值低于6。
  可以用试剂盒中的洗柱液、裂解液、洗涤液稀释蛋白样品。
  植物组织蛋白提取：
  
  • 裂解液制备：每500μL冷的提取液中加入2μL蛋白酶磷酸酶抑制剂，混匀后置冰上备用。
    
  • 取200mg植物组织样本，去除粗筋脉络等后洗净擦干，用手术剪刀剪碎，加入500μL蛋白裂解液B，然后用匀浆机/匀浆器充分匀浆。
    注：
    ● 也可置于研钵中用液氮研磨。研磨后加入500μL提取液。
    ● 没有液氮条件也可直接置冰上加入裂解液研磨即可。
    
  • 将匀浆液吸入一个预冷的干净离心管中在4℃条件下振荡2～3小时。
    注：
    ● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
    ● 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔20分钟用移液器吹打混匀即可。
    
  • 在4℃，14000×g条件下离心15分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。
• 柱平衡：
  加入500μL洗柱液洗柱，重力作用下自然流下或4℃下500×g力离心1分钟甩干吸附柱。
  
• 上样：
  将以上蛋白裂解液或其它待富集蛋白样品加入吸附柱，重力作用下自然流下或4℃下500×g力离心1分钟甩干吸附柱。
  
• 洗柱：
  加入300μL洗涤液洗柱，重力作用下自然流下或4℃下500×g力离心1分钟甩干吸附柱。重复两次。
  
• 洗脱：
  加入500μL磷酸化蛋白洗脱液，重力作用下自然流下或4℃下1000×g力离心1分钟甩干吸附柱，收集洗脱液，即得到磷酸化蛋白。
  
• 柱保存和柱再生：
  磷酸化蛋白纯化柱如果保存和处理得当的话可以多次重复使用。
  使用后可以用1mL 0.1M EDTA溶液洗柱，然后在柱中加入20%乙醇溶液密封，置2～8℃保存。
  加入0.1M氯化铁溶液，浸泡蛋白柱填料，即可对蛋白柱进行再生。