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本制品是一种方便高效的高产膜蛋白提取试剂盒。支原体膜蛋白提取试剂盒可以从各种支原体中提取总膜蛋白，可用于纯化蛋白的粗品制备及膜蛋白制备。提取过程简单方便。该试剂盒含有蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高质量的蛋白提供了保证。

• 本试剂盒提取的蛋白具有天然活性，提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫共沉淀、质谱等各种下游蛋白研究。
  
• 本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
  
• 本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用百奥莱博其他货号的试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用蛋白脱盐柱脱盐处理。

• 使用方便，将蛋白提取的时间缩短至1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
  
• 本试剂盒不含EDTA，可以用于金属螯合层析等下游应用。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期，试剂拆封后请尽快使用完。

• 仪器准备：离心机、振荡器、涡旋混匀器、移液器、冰箱、冰盒
  
• 试剂准备：1×PBS(10mM,pH7.4)、蛋白定量试剂盒
  
• 耗材准备：离心管、吸头、一次性手套

• 预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。
  
• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
  
• 提取液A在使用前须一直置于2～8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
  
• 膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。
  
• 膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。

• 提取液准备：每500μL提取液A中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。
  
  • 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
    
  • 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
    
  • 提取液A在使用前须一直置于2～8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
  • 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
• 收集好的支原体样本用PBS洗涤后，加入300～500μL冷的提取液A，充分混匀。
  
  • 细胞数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。
    
  • 由于膜蛋白含量较少，需要较多的细胞才能保证得率。在条件允许的情况下，尽可能加大细胞上样量。
• 置2～8℃条件下振荡30分钟～2小时。至支原体裂解完全，沉淀体积明显减少。
  
  • 此步骤必须在2～8℃条件振荡。
    
  • 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
    
  • 如果没有2～8℃持续振荡条件，也可直接置2～8℃冰箱静置1～2小时，中间每隔10分钟用移液器吹打混匀即可。
• 将提取液在2～8℃低温下12000×g离心5分钟，取上清。
  
• 在上清中加入3～5μL提取液B，充分混匀。
  
• 在37℃水浴10分钟。
  
• 在37℃，1000×g离心3分钟。
  
  • 此步骤必须37℃条件下离心。
    
  • 如果离心机不可控温，可以不离心，延长上一步骤水浴时间，至溶液分层清晰即可。或者室温极短的时间离心。
• 此时液体分为2层，小心移除上层溶液，留管底部下层大约30～50μL液体。
  
  • 下层为粘稠状液体。
• 用1～2倍体积的膜蛋白溶解液C溶解该溶液，即得支原体膜蛋白样品。
  
  • 膜蛋白比较难溶解，不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于4℃冰箱静置至溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀一次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。
    
  • 静置直至管底透明胶状物完全溶解。
• 该样品可以用BCA方法进行定量，调整相应的浓度用于下游实验。

• 建议用BCA法进行蛋白定量。
  
• 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低：膜蛋白丰度较低，需要尽可能加大细胞上样量。处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 蛋白定量方法：建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组分，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白的活性：本试剂盒不含有离子型去垢剂组分，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
  
• 膜蛋白电泳没有条带：
  
  • 膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
    
  • 蛋白样品中含有去垢剂，注意蛋白定量方法的选择，防止不合适的方法导致的蛋白浓度数据异常偏高，从而导致依据错误的蛋白浓度数据上样导致上样量不够。
    
  • 膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
    
  • 蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
    
  • 蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%～10%。
    
  • 有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
    
  • 电泳时最后采用低电压低电流电泳。