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本制品是一种快速、高效、高产的膜蛋白提取试剂盒，适用于从动物细胞和动物组织中提取总膜蛋白。本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解细胞膜组分，包括细胞质膜、核膜和各种细胞器膜。

• 提取过程简单方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理，将蛋白提取的时间缩短至1小时完成。
  
• 提取的膜蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。
  
• 本试剂盒含蛋白稳定剂，提高了提取蛋白的稳定性。
  
• 本试剂盒含蛋白酶抑制剂，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。
  
  • 蛋白酶抑制剂混合物配方经过优化，包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
    
  • 蛋白酶抑制剂混合物中不含AEBSF，可以避免由于AEBSF导致的质谱峰漂移，因此使用本制品提取的蛋白样品可以用于质谱检测和分析，蛋白质组学等相关研究。
    
  • 蛋白酶抑制剂混合物中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
• 本试剂盒的蛋白提取组分中不含有不可透析除去的去垢剂组分，不含SDS、Triton X-100、chaps等可能影响质谱实验的组分，基本可以满足下游任意的蛋白质组学相关实验研究。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。

本试剂盒提取的蛋白也可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

动物跨膜蛋白承担各种生物功能，在疾病的发生、发展过程中扮演重要角色。膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析及质谱分析等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。

• 有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期，试剂拆封后请尽快使用完。
  
• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存，开盖使用后-20℃储存。

• 仪器准备：离心机、振荡器、匀浆机/匀浆器、涡旋混匀器、移液器、冰箱、冰盒
  
• 试剂准备：1×PBS（pH7.4，约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl）、蛋白定量试剂盒
  
• 耗材准备：离心管、吸头、一次性手套

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 提取液A在使用前须一直置于2～8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
  
• 膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。
  
• 膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

• 提取液准备：
  
  • 每500μL冷的蛋白提取液A中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    
  • 每500μL膜蛋白溶解液C中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  • 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
    
  • 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
    
  • 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶、磷酸酶活性等下游实验时，注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。
    
  • 提取液A在使用前须一直置于2～8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
    
  • 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
• 取5～10×10⁶个以上细胞，在4℃，500×g条件下离心3～5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
  
  • 贴壁细胞可以从培养器皿上消化下来或者用一次性细胞刮刀刮下来后处理，也可以直接原位裂解处理。
    
  • 原位处理时先小心吸取贴壁细胞的培养液，用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干PBS。加入适量冷的蛋白提取液A，4℃振荡20～30分钟，至细胞充分裂解，用细胞刮刀刮一遍，将裂解液吸入另一干净离心管。
    
  • 原位裂解时推荐提取液A使用量：60mm培养皿250μL～500μL；100mm培养皿500μL～1mL；
    
  • 6孔板200～250μL/孔；24孔板100μL/孔；96孔板50μL/孔；75cm2培养瓶500μL～1mL。
    
  • 如果是组织样本，取50mg～100mg组织样本，用冷PBS洗干净，然后用手术剪刀尽可能剪碎，加400μL冷的试剂A，用组织匀浆机/器匀浆至无明显肉眼可见固体。如果组织样品很细小，可以剪碎后直接加入提取液振荡20～30分钟，可以不用匀浆器。一般按组织：提取液用量1∶5(w/v)左右加入提取液即可。将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在4℃条件下振荡20～30分钟。按照细胞蛋白的提取方法的第5步骤往下操作即可。
• 用冷PBS，2000×g，离心3～5分钟，洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
  
• 细胞样品中加入400μL冷的试剂A，充分混匀。
  
  • 细胞数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。
    
  • 由于膜蛋白含量较少，需要较多的细胞才能保证得率。在条件允许的情况下，尽可能加大细胞上样量。
    
  • 提取液A在使用前须一直置于2～8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
• 在2～8℃条件下振荡20～30分钟，至细胞充分裂解，细胞沉淀明显减少。
  
  • 此步骤必须在2～8℃条件振荡。
    
  • 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
    
  • 没有2～8℃振荡条件也可以不振荡，置2～8℃静置，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
    
  • 此步如果细胞裂解不充分，下步有大量细胞沉淀，请延长2～8℃振荡裂解时间至40分钟或更长，直至细胞充分裂解。
• 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
  
• 将上清吸入另一干净离心管，在37℃水浴10分钟。
  
• 在37℃，1000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为50μL。
  
  • 此步骤必须在37℃条件下离心。
    
  • 没有37℃离心条件也可以不离心，稍微延长37℃水浴时间，至液体澄清，分层清晰。
    
  • 下层膜蛋白部分为粘稠状液体。
• 小心移除上层液体，收集上层部分留作备用分析。
  
  • 上层部分为细胞胞浆蛋白。
    
  • 待下游目的膜蛋白实验完成后在丢弃此部分。膜蛋白萃取不完全时此部分蛋白仍可以进行再次提取膜蛋白。
    
  • 进行下游实验时，可用试剂C分别稀释上层和下层，取一个上层样品同时进行实验分析。
    
  • 如果对膜蛋白的纯度要求极高，可以使用试剂B再次进行纯化，增加以下操作步骤9.b。一般不需要做此步，增加了9.b操作步骤以后，蛋白回收率会下降。
    
  • 步骤9.b：用150～200μL冰冷的试剂B充分溶解下层50μL膜蛋白部分，混匀后冰浴至下层完全溶解，37℃水浴5～10分钟，37℃，1000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是结果再次纯化的膜蛋白约为50μL。小心移除上层液体，保留下层膜蛋白约为50μL。
• 用850μL冷的试剂C膜蛋白溶解液溶解下层膜蛋白部分，即得膜蛋白粗提液。
  
  • 膜蛋白比较难溶解，不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于4℃冰箱静置至溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀一次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。
    
  • 于4℃静置直至管底透明胶状物完全溶解。
• 在900μL膜蛋白粗提液样本中加入100μL试剂E，充分混匀。
  
• 冰浴或4℃冰箱静置30分钟以上，也可以4℃静置过夜。
  
• 在4℃，15000×g以上条件下离心15分钟。
  
  • 使用离心机能达到的最大离心力。
• 小心移除上层清液丢弃，留沉淀。
  
  • 蛋白量较少时可能很难看到沉淀。
• 将离心管倒置在吸水纸上干燥离心管。
  
• 加入200μL试剂F到离心管中。
  
• 在4℃，15000×g以上条件下离心15分钟。弃上清，留沉淀。
  
• 将离心管倒置在吸水纸上干燥离心管。
  
  • 或开盖敞口静置至液体完全干燥。
• 用40～100μL试剂G溶解蛋白沉淀，充分混匀。
  
  • 或者加入20～50μL 1X蛋白Loading buffer，煮10nim直接用于下游实验。
• 在4℃，10000×g条件下离心10分钟。
  
• 收集上清用于下游实验。
  
  • 建议用BCA法蛋白定量。
    
  • 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
• 将蛋白样品透析处理或者脱盐柱脱盐处理后用于下游实验。
  
  • 蛋白样品中含有盐，需要脱盐处理后用于双向电泳。
    
  • 经透析或脱盐离心柱处理的蛋白样品不含有去垢剂和高浓度盐。

• 蛋白浓度低？
  
  • 膜蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大细胞的上样量以提高膜蛋白浓度。
    
  • 处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
• 用什么方法定量蛋白？
  
  • 建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组分，导致定量不准。
    
  • 如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
• 膜蛋白电泳没有条带？
  
  • 膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
    
  • 膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
    
  • 蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
    
  • 蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%～10%。
    
  • 有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
    
  • 电泳时最好采用低电压低电流电泳。
    
  • 膜蛋白丰度通常较低，有条件可以尝试用银染染色。