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本试剂盒适用于从各种动物细胞和实体软、硬组织样本的高尔基体提取。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用我公司其他货号的试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理（相关产品HR0389）。

高尔基体是由许多扁平的囊泡构成的以分泌为主要功能的细胞器。又称高尔基器或高尔基复合体；高尔基体是由数个扁平囊泡堆在一起形成的高度有极性的细胞器。常分布于内质网与细胞膜之间，呈弓形或半球形，凸出的一面对着内质网称为形成面（forming face）或顺面（cis face）。凹进的一面对着质膜称为成熟面（mature face）或反面（trans face）。顺面和反面都有一些或大或小的运输小泡，在具有极性的细胞中，高尔基体常大量分布于分泌端的细胞质中。因其看上极像滑面内质网，因此有科学家认为它是由滑面内质网进化而来的。

高尔基体中的酶主要有糖基转移酶、磺基-糖基转移酶、氧化还原酶、磷酸酶、蛋白激酶、甘露糖苷酶、转移酶和磷脂酶等不同的类型。高尔基体的主要功能将内质网合成的蛋白质进行加工、对比分类、与包装，然后分门别类地送到细胞特定的部位或分泌到细胞外。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 最好使用Dounce匀浆器匀浆，如果没有Dounce匀浆器，用普通1mL玻璃匀浆器匀浆也可，但是蛋白回收率会下降。

• 细胞高尔基体提取：
  
  • 提取液准备：
    每500μL冷的蛋白提取液D中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    注：
    ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
    ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
    
  • 取1～2×10⁷个细胞，在4℃，500×g条件下离心2～3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
    
  • 用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
    
  • 加入400μL冷的试剂A，置冰上10分钟。
    
  • 用Dounce匀浆器充分匀浆几分钟，然后在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。
    
  • 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
    
  • 在4℃，3000×g力条件下离心10分钟。
    
  • 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
    
  • 在上清中加入10μL试剂WT，在4℃，20000×g力条件下离心20分钟。
    
  • 弃上清，在沉淀中加入500μL冷的试剂B，混匀。
    
  • 在4℃，20000×g力条件下离心30分钟。弃上清，收集沉淀。
    
  • 在沉淀中加入100～300μL蛋白提取液D，吹打混匀后，在4℃条件下振荡15～20分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。
    注：
    ● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
    ● 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
    
  • 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到高尔基体蛋白样品。
    
  • 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
    注：
    ● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
    ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
• 组织高尔基体提取：
  
  • 提取液准备：
    每500μL冷的蛋白提取液D中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    注：
    ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
    ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
    
  • 取50～100mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。
    
  • 用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。
    
  • 加入400μL冷的试剂A，置冰上10分钟。
    
  • 用Dounce匀浆器充分匀浆几分钟，然后在4℃，1000g力条件下离心5分钟。
    
  • 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
    
  • 在4℃，3000×g力条件下离心10分钟。
    
  • 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
    
  • 在上清中加入10μL试剂WT，在4℃，20000×g力条件下离心20分钟。
    
  • 弃上清，在沉淀中加入500μL冷的试剂B，混匀。
    
  • 在4℃，20000×g力条件下离心30分钟。弃上清，收集沉淀。
    
  • 弃上清，沉淀用高尔基体保存液重悬。
    
  • 在沉淀中加入100～300μL蛋白提取液D，吹打混匀后，在4℃条件下振荡15～20分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。
    注：
    ● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
    ● 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
    
  • 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到高尔基体蛋白样品。
    
  • 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
    注：
    ● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
    ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。