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本试剂盒可用于各种动物细胞和实体软、硬组织样本的溶酶体蛋白提取。适用于从各种原代或传代细胞和各种实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等动物组织中提取溶酶体总蛋白。

本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解膜组份。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用我公司其他货号的试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理（相关产品HR0389）。

• 使用方便，从细胞，组织提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 提取过程简单方便。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 总蛋白提取液含多种有效成分，可充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出蛋白防止沉淀。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 最好使用Dounce匀浆器匀浆，如果没有Dounce匀浆器，用普通玻璃匀浆器匀浆也可，但是溶酶体蛋白回收率会下降。
  
• 若实验室离心机较小达不到30000×g离心力，或者离心管质量不能承受30000×g离心力，请使用能达到的最大离心力。

• 细胞溶酶体蛋白提取：
  
  • 取1～2×10⁷个细胞，在4℃，500×g条件下离心2～3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞；
    
  • 用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
    
  • 加入500μL～1000μL冷的试剂A，置冰上振荡10分钟。
    
  • 用Dounce匀浆器匀浆30～40下。
    
  • 在4℃，1000×g力条件下离心5分钟，弃沉淀，留上清。
    
  • 将上清在4℃，4000×g条件下离心10分钟，弃沉淀，留上清。
    
  • 将上清在4℃，20000×g力条件下离心20分钟，弃上清，留沉淀。
    
  • 在沉淀中加入500μL冷的试剂B，混匀。
    
  • 在4℃，20000×g力条件下离心20分钟，弃上清，留沉淀。
    
  • 在沉淀中加入100～200μL蛋白提取液C，充分混匀。
    
  • 轻微振荡15～30分钟。
    注：
    ● 用振荡器或脱色摇床/平板摇床较低转速，保持液体有轻微的晃动即可。
    ● 没有2～8℃振荡条件时室温振荡即可。
    ● 没有振荡条件时也可不振荡，稍微延长提取液C处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
    
  • 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得到溶酶体总蛋白。
    
  • 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
    注：
    ● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
    ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
• 组织溶酶体蛋白提取：
  
  • 取50～100mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。
    
  • 用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。
    
  • 加入500μL～1000μL冷的试剂A，置冰上10分钟。
    
  • 用Dounce匀浆器匀浆30～40下，至无明显可见固体。
    
  • 在4℃，1000×g力条件下离心5分钟，弃沉淀，留上清。
    
  • 将上清在4℃，4000×g力条件下离心10分钟，弃沉淀，留上清。
    
  • 将上清在4℃，20000×g力条件下离心20分钟，弃上清，留沉淀。
    
  • 在沉淀中加入500μL冷的试剂B，混匀。
    
  • 在4℃，20000×g力条件下离心20分钟，弃上清，留沉淀。
    
  • 在沉淀中加入100～200μL蛋白提取液C，充分混匀。
    
  • 轻微振荡15～30分钟。
    注：
    ● 用振荡器或脱色摇床/平板摇床保持液体有轻微的晃动即可。
    ● 没有2～8℃振荡条件时室温振荡即可。
    ● 没有振荡条件时也可不振荡，稍微延长提取液C处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
    
  • 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得到溶酶体总蛋白。
    
  • 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
    注：
    ● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
    ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低？
  溶酶体蛋白丰度较低，需要足够的样品量才能得到足够的蛋白，在条件允许的情况下，适当增加细胞或组织样本的上样量。处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂C中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。