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本试剂盒适用于从各种原代或传代细胞和各种实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等哺乳动物组织中分步提取细胞膜蛋白/胞浆蛋白/细胞核膜蛋白/核内蛋白。提取过程简单方便，可在2小时内完成。该试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。本试剂盒含有的独特配方能够溶解细胞膜包括细胞质膜和核膜。提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫共沉淀等下游蛋白研究。

• 使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含7种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

• 提取液制备：每400μL冷的蛋白提取液A/D中加入分别加入2μL蛋白酶抑制剂混合物和2μL磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  
• 取5～10×10⁶个细胞①，在4℃，1000rpm条件下离心5～10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，用细胞刮刀收集细胞。（组织样本50～100mg剪碎，加冷PBS，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置5分钟，小心将匀浆吸入另一预冷的干净离心管。在4℃，500×g条件下离心2～3分钟，弃上清。）
  注：细胞数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。
  
• 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
  
• 每5×10⁶个细胞中加入400μL冷的蛋白提取液A，混匀后，在4℃条件下用试剂盒所配针筒反复吸吹细胞，使细胞完全破裂。
  
• 在4℃，1000×g条件下离心5分钟。
  
• 快速将上清（I）吸入另一预冷的干净离心管，在沉淀中加入200μL冷的提取液B，高速涡旋振荡15秒。
  
• 将混匀的提取液B置2～8℃振荡1～2小时，至沉淀充分裂解，沉淀明显减少。
  
• 37℃水浴10分钟，37℃下1000×g～2000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），上层为核内蛋白，下层是核膜蛋白约为20～40μL。小心移除上层，用1～2倍体积的提取液D溶解下层即为细胞核膜蛋白。
  注：必需保证在37℃左右下离心，至少确保30℃以上。无可控温的离心机时，用常温的离心机在室温离心即可，适当缩短离心时间至2～3分钟。
  
• 在步骤6中所得到的上清（I）中加入5μL提取液C，充分混匀。37℃水浴10分钟。
  
• 37℃下1000×g离心3分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），上层是胞浆蛋白部分，下层是细胞膜蛋白部分约为40～50μL。
  注：必需保证在37℃左右下离心，至少确保30℃以上。无可控温的离心机时，用常温的离心机在室温离心即可，适当缩短离心时间至2～3分钟。
  
• 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白。
  
• 用80～200μL冰冷的提取液D溶解步骤10中的下层部分，即得细胞膜蛋白。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ● 建议用BCA法进行蛋白定量。
  ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。