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本制品是一种高效的高产膜蛋白提取试剂盒，可以从各种革兰氏阳性菌菌体中提取膜蛋白，用于纯化蛋白的粗品制备及膜蛋白制备。提取过程简单方便。本试剂盒含有特别的配方能有效溶解细胞膜成分。试剂盒含有蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高质量的蛋白提供了保证。

• 使用方便，从革兰氏阳性菌中提取膜蛋白不需经过超声破碎等前处理。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。
  
• 本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请选择细菌总蛋白提取试剂盒(双向电泳用)。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用蛋白脱盐柱脱盐处理。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 试剂拆封后请尽快使用完！

• 离心机、振荡器、涡旋混匀器、移液器、冰箱、冰盒
  
• PBS缓冲液、蛋白定量试剂盒
  
• 耗材准备：离心管、吸头、一次性手套

• 预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。
  
• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 提取液A在使用前须一直置于2～8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

• 提取液制备：
  每500μL冷的提取液A中加入5μL提取液B和2μL蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。
  
• 离心收集革兰氏阳性菌菌体，用PBS洗菌体2次。
  按每100～150mg湿重菌体样本加入500μL冷的提取液A（大约菌体和提取液体积比1:3～1:5，完全淹没菌体即可），吹打混匀，在2～8℃振荡1～2小时，至菌体裂解完全，液体澄清，菌体沉淀减少。
  
• 将菌液在2～8℃低温下12000×g离心5分钟，取上清。
  
• 在37℃水浴/气浴10分钟。
  
• 在37℃，1000×g离心3分钟。
  
• 此时液体分为2层，小心移除上层溶液，留管底部下层，大约50μL液体。
  
• 用50～200μL冷的膜蛋白溶解液溶解该溶液，即得革兰氏阳性菌膜蛋白样品。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

• 蛋白浓度低？
  膜蛋白丰度较低，需要尽可能加大细胞上样量。处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组分，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组分，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
  
• 膜蛋白电泳没有条带？
  膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
  蛋白样品中含有去垢剂，注意蛋白定量方法的选择，防止不合适的方法导致的蛋白浓度数据异常偏高，从而导致依据错误的蛋白浓度数据上样导致上样量不够。
  膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
  蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
  蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%～10%。
  有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
  电泳时最后采用低电压低电流电泳。