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免疫印迹最重要也是最后一步就是酶与底物反应进行检测，本试剂盒以化学荧光发光方法检测蛋白质或核酸类生物大分子。其原理是，蛋白质或核酸在电泳后转移到印迹膜上，以一抗及辣根过氧化物酶HRP标记的二抗结合膜上的目的蛋白，或以HRP标记的探针直接或间接结合膜上的核酸。洗膜后用本制品配制的ECL工作液，在可见光下室温孵育膜数分钟，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒。然后转入暗室将X光胶片压在膜上曝光数秒到数分钟至数小时。显影定影后蛋白质或核酸条带可清晰显示在X光胶片上。也可不进行X光胶片曝光直接对印迹膜进行荧光CCD扫描。

本试剂盒采用高品质原料，经大量样本实验验证优化配方。稳定性高，检测方便，可检测pg级的抗原。

• ECL工作液配制过程中吸取试剂A和试剂B时务必跟换吸头，工作液新鲜配制后立即使用，放置过久会影响灵敏度。
  
• 根据蛋白丰度不同曝光时间可能是数秒至数小时。
  
• 曝光时间过长会使背景加深，曝光不足会导致条带模糊。
  
• 如果曝光后条带不佳，可用洗膜缓冲液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL发光和曝光。
  
• 必须使用高质量保鲜膜。

• 使用合适的方法进行Western，直至用PBST洗涤二抗。
  
• 配制新鲜ECL工作液：试剂A和试剂B按1:1混合均匀后即为ECL工作液。须立即使用！
  
• 印迹膜蛋白面朝上，用ECL工作液均匀滴加至印迹膜使其完全覆盖。ECL工作液使用量大约为0.125mL/cm2膜或根据个人实验习惯使用。
  
• 用平头镊夹住印迹膜，垂直置于吸水纸以吸去自然流下的多余工作液，注意不能让膜完全干掉。
  
• 快速将印迹膜置于二层保鲜膜之间，尽量赶尽气泡。
  
• 将印迹膜蛋白面朝上，放于X光胶片暗盒内。（如果用显像仪器直接置于仪器中拍照即可）
  
• 在暗室内放入X光片，曝光，显影。如果在暗室中可肉眼看到比较亮的条带，建议曝光1分钟～3分钟；如果肉眼看到的带比较淡，建议曝光3～10分钟；如果很淡或基本看不到带，建议曝光10分钟～30分钟。

• 为什么会发生荧光淬灭？
  抗原浓度太高，局部过多HRP会快速消耗底物，导致荧光信号过强，条带呈灼烧样。可降低抗原上样量。
  操作时间过长，膜逐渐干掉。避免膜干掉。
  不良的实验习惯导致设备或试剂污染。例如铁锈和不慎沾染的显影液、定影液，会造成荧光淬灭，甚至直接导致无荧光。
  
• 为什么会出现高背景？
  抗体浓度过高，洗涤不充分，可以造成抗体在膜上的非特异结合，导致高背景。可通过降低抗体稀释度，增加洗膜次数和Buffer用量，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20加以改善。
  封闭不充分，会造成抗体在膜上的非特异结合，导致高背景。可通过4℃封闭过夜或增加封闭液中的蛋白浓度加以改善。
  使用了不恰当的封闭剂，可尝试不同的封闭剂。
  曝光过度，可减少底物显色时间，缩短曝光时间。
  操作过程中膜干了。确保膜完全浸没于buffer中，始终杜绝膜干。
  
• 胶片上条带很浓怎么办？
  可减少蛋白上样量；
  降低一抗二抗稀释度，减少抗体孵育时间；
  如果背景深的话，则要把发光液沥干些再压片；如果背景不深则需减少发光时间和显影时间。
  
• 胶片上条带很弱是什么原因？
  因为蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成。可适当加大蛋白上样量，也可通过提高抗体稀释度或采用灵敏度更高的发光底物来调整。
  蛋白没有充分转移到膜上。转膜后可通过预染Marker判断转膜效率，也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶，判断转膜效率。
  抗体效价不高，用量不足，孵育时间太短，或抗体反复使用保存不当而失活。
  可考虑更换效价更高的抗体，或提高抗体稀释度，延长抗体孵育时间；若怀疑抗体失活，可用斑点杂交实验确定抗体活性。
  曝光时间太短。可适当延长曝光时间。
  
• 出现非特异条带是什么原因？
  蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。
  一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。
  洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20。
  目的蛋白在体内存在多种修饰形式，如乙酰化，甲基化，磷酸化，糖基化等。可查阅文献，用合适的方法去除蛋白的修饰，或选择合适的抗体。
  目的蛋白降解。重新准备蛋白样品，并加入足够的蛋白酶抑制剂。
  
• 如何判断ECL是否失效？
  准备ECL工作液1mL到一个干净的EP管中，加入1μL未稀释的HRP酶标二抗到EP管中，混匀后即可看到管内发出蓝光，并在随后的几分钟内持续发光，表示底物活性正常。若不发光则说明ECL失效了。