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本试剂盒可用于各种动物细胞和实体软、硬组织样本的内质网的提取。本试剂盒适用于各种粗面内质网和光面内质网的提取。本试剂盒可以用于完整内质网提取相关的实验，也可用于下游内质网蛋白提取等实验。

• 提取液长期不用时置于-20℃保存，15天内要多次使用的话置4℃保存即可。
  
• 试剂拆封后请尽快使用完！
  
• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 最好使用Dounce匀浆器匀浆，如果没有Dounce匀浆器，用普通1mL玻璃匀浆器匀浆也可以。
  
• 要求离心力30000×g～50000×g的离心，最好能达到50000×g左右。最小离心力需要保证30000×g。

• 细胞内质网提取：
  
  • 取1～2×10⁷个细胞，在4℃，500×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞；
    
  • 用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
    注：
    ● 在500×g条件下离心5分钟。
    
  • 加入500μL～1mL冷的试剂A，置冰上10分钟。
    
  • 用Dounce匀浆器匀浆30～40下。
    
  • 将匀浆液在4℃，1000×g离心5分钟，弃沉淀，收集上清。
    
  • 将上清在4℃，11000×g离心10分钟，弃沉淀，收集上清。
    
  • 将上清在4℃，50000×g离心45分钟，弃上清，收集沉淀。
    注：
    ● 如果条件允许，将离心力加大到100000×g，有利于提高光面内质网小泡回收率。
    ● 如果用大的离心转头，液体量太少不好离心的话，可以添加PBS增加液体量。
    
  • 在沉淀中加入400μL冷的试剂B，混匀。
    
  • 在4℃，50000×g离心45分钟。
    注：
    ● 如果用大的离心转头，液体量太少不好离心的话，可以添加PBS增加液体量。
    ● 如果期望回收所有光面内质网小泡，离心力需要提高到100000×g力。
    
  • 弃上清，沉淀用试剂C内质网保存液重悬。
    注：
    ● 也可不用盒中的内质网保存液重悬，根据实验需要选择合适的缓冲液重悬内质网或直接用于下游实验。
    
  • 即得到内质网样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。
• 组织内质网提取：
  
  • 取50～100mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。
    
  • 用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。
    注：
    ● 在500×g条件下离心5分钟
    
  • 加入500μL～1mL冷的试剂A，置冰上10分钟。
    
  • 用Dounce匀浆器匀浆30～40下，至无明显固体团块。然后4℃，1000×g离心5分钟。
    
  • 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。
    
  • 在4℃，11000×g离心10分钟，弃沉淀，收集上清。
    
  • 将上清在4℃，50000×g离心45分钟，弃上清，收集沉淀。
    注：
    ● 如果条件允许，将离心力加大到100000×g，有利于提高光面内质网小泡回收率。
    ● 如果用大的离心转头，液体量太少不好离心的话，可以添加PBS增加液体量。
    
  • 在沉淀中加入400μL冷的试剂B，混匀。
    
  • 在4℃，50000×g离心45分钟。
    注：
    ● 如果用大的离心转头，液体量太少不好离心的话，可以添加PBS增加液体量。
    ● 如果期望回收所有光面内质网小泡，离心力需要提高到100000×g力。
    
  • 弃上清，沉淀用内质网保存液重悬。
    ● 也可不用盒中的内质网保存液重悬，根据实验需要选择合适的缓冲液重悬内质网或直接用于下游实验。
    ● 需要提取内质网蛋白时可以直接在沉淀中加入适量蛋白裂解液进行裂解。
    
  • 即得到内质网样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。