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本试剂盒用简便快速的方法可以从各种植物样本中提取叶绿体膜蛋白，提取过程简单方便，可在一小时内提取得到高质量的叶绿体膜蛋白。本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解膜组份。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。本试剂盒提取的蛋白可用于WB、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用我司其他货号的试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理（货号HR0389）。

本试剂盒采用非酶法提取，提取过程简单方便，速度快，可在1小时内完成，而且绝少交叉污染，但是蛋白回收率相比酶法较低。酶法提取制备的蛋白，回收率稍有提高，蛋白纯度高，保持天然活性，但是耗时较长。如果需要更加快捷的提取试剂盒，可以选择非酶法的提取试剂盒，对提取速度没有要求的话，可以选择酶法提取试剂盒。

• 使用方便，提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 提取过程简单方便，将蛋白提取的时间缩短至1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 操作时必须按照下面步骤里的温度条件，否则严重影响膜蛋白的回收率。

• 提取液制备：
  每500μL冷蛋白提取液B中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  注：
  ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
  
• 取500mg～1g新鲜植物叶片样本，用纯水洗净擦干后去除叶梗和粗脉，用手术剪刀尽可能剪碎。
  
• 加入2mL提取液A用组织搅碎机/匀浆机/Dounce匀浆器充分匀浆。
  注：
  ● 匀浆尽可能充分，至无明显可见固体。
  ● 培养细胞直接收集细胞后用Dounce匀浆器匀浆即可，匀浆后加提取液A混匀后直接进行以下步骤离心。
  ● 处理叶片等组织样本如果没有匀浆机，也可先加少量提取液A后用Dounce匀浆器充分匀浆后再加提取液A混匀。
  
• 将匀浆用100μm细胞筛过滤。
  注：
  ● 没有细胞筛时可以不过滤，将匀浆液静置1分钟，待大的没有破碎的组织块自然沉降，吸取上清。
  ● 部分粘液较多的植物样本可能难以吸取，可以将1mL吸头的口剪掉一点再吸。
  
• 将滤液500×g力离心3分钟，将上清移入另一干净离心管。
  
• 将上清3000×g力离心10分钟，弃上清，收集沉淀。
  
• 在沉淀中加入500μL蛋白提取液B，充分混匀。在2～8℃条件下振荡1小时。
  注：
  ● 此步骤必须保持低温条件下振荡。
  ● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
  ● 如果没有低温振荡条件也可以不振荡，在2～8℃静置，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
  
• 将提取液在4℃，12000×g条件下离心5分钟，取上清。
  
• 在37℃水浴10分钟。
  
• 在37℃，500～1000×g离心3分钟。
  ● 此步骤必须37℃条件下离心。
  ● 如果离心机不可控温，可以不离心，延长上一步骤水浴时间，至溶液分层清晰即可。或者在室温条件下离心，缩短离心时间至1分钟。
  
• 此时溶液分为两层，小心移除上层，保留下层溶液，大约30～50μL。
  注：
  ● 下层为粘稠状液体。
  ● 下层叶绿体膜蛋白为黄绿色，通常不影响下游实验。
  
• 用50～150μL冷的膜蛋白溶解液C溶解下层溶液，即得叶绿体膜蛋白样品。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或调整相应的浓度后直接用于下游实验。
  注：
  ● 建议用BCA方法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
  ● 蛋白样品-80℃存放一年没问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低？
  膜蛋白丰度比较低，需要足够的植物样本上样量才能提高担蛋白浓度。在条件允许的情况下，尽可能提高上样量。
  也可能第7步处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂B的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  注意第3步处理组织样本要充分，在整个后续的离心过程中不要将叶绿体丢掉了，根据颜色判断即可。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。