产品目录

本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解细胞线粒体膜，含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。适用于从各种实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等动物组织中提取线粒体蛋白。提取过程简单方便。制备的线粒体蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。

本试剂盒不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容，提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白，可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本产品提取蛋白样本含高浓度盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需直接用于等电聚焦、双向电泳，请用其他货号。也可将样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理（相关产品HR0389）。

• 使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 将蛋白提取的时间缩短至1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含7种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
  
• 最好使用Dounce匀浆器匀浆，如果没有Dounce匀浆器，用普通1mL玻璃匀浆器匀浆也可，但是线粒体回收率会下降。

• 提取液准备：
  根据样本数量，每200μL冷的蛋白提取液C中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  注：
  ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
  
• 取50～100mg新鲜组织样本，用手术剪刀尽可能剪碎。
  注：
  ● 由于线粒体蛋白含量较少，需要较多的样本才能保证得率。
  
• 用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
  注：
  ● 加入PBS缓冲液，500×g离心5分钟。
  
• 加入400μL冷的试剂A，置冰上10分钟。
  
• 用Dounce匀浆器匀浆30～40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。
  
• 将上清吸入另一预冷的干净离心管，弃沉淀。
  
• 在4℃，1000×g条件下离心10分钟。
  
• 在4℃，10000×g条件下离心20分钟。
  
• 在沉淀中加入200μL冷的试剂B，混匀。
  
• 在4℃，10000×g条件下离心20分钟。
  
• 弃上清，收集沉淀。
  
• 在沉淀中加入80μL～150μL蛋白提取液C，充分混匀。置4℃振荡20～30分钟。
  注：
  ● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
  ● 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
  ● 至无明显沉淀。
  
• 在4℃，14000×g条件下离心15分钟。
  
• 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得线粒体蛋白。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
  ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低？
  处理部分线粒体样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂C的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。