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本试剂盒可以选择性的对糖蛋白和多肽进行富集和纯化。利用糖蛋白亲和纯化柱与糖蛋白之间的共价配位作用实现分离纯化。纯化柱填料采用无定形硅胶填料，具有键合相稳定，键合率高等特点，平均粒径为50微米，亲和层析介质可以用于各种样本糖蛋白的分离纯化富集。

特点：基团脱落少，结合特异性强
配基密度：20μmol/mL
吸附载量：1mg Con A/柱
最大流速：300cm/h
pH范围：3-10，在位清洗时pH范围可到2-13
使用温度：4℃～常温
保存温度：+4～8℃

组分	50T	100T
试剂A:洗柱液A	50mL	100mL
试剂B:蛋白裂解液B	25mL	50mL
试剂C:洗涤液C	50mL	100mL
试剂D:蛋白洗脱液D	50mL	50mL
试剂E:蛋白酶抑制剂混合物	100μL	200μL
试剂F:糖蛋白吸附柱	5	10

保存：蛋白酶抑制剂-20℃保存；其他组份2～8℃保存；蛋白柱室温避光保存。有效期1年。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

移液器、离心机、涡旋混匀器、振荡器、生理盐水

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 蛋白样品中不可含Tris。
  
• 蛋白样品不可以含有三乙醇胺类的物质。
  
• 蛋白样品中可以含有二价阳离子、非离子表面活性剂。
  
• 上样蛋白样品pH值必须高于8，最好在8-9，蛋白浓度在0.25～0.5mg/mL。
  
• 洗涤细胞和组织是不能用Tris缓冲液。
  
• 每个新柱的最大载量约为1mg糖蛋白，使用过的柱子经过再生反复使用的，载量会有下降。
  
• 用蛋白柱进行糖蛋白富集，需要离心操作时可以将蛋白柱置于一个50mL离心管离心即可。
  
• 最终蛋白样品用于2D电泳前需脱盐。

一、蛋白样品的准备：
以下为由细胞和组织制备蛋白样品的参考步骤。
其它方法得到的蛋白样品稀释至蛋白浓度为0.25～0.5mg/mL后直接上样即可，确保蛋白样品的pH值高于8，并且蛋白样品中不含Tris和高浓度糖。
可以用试剂盒中的洗柱液、裂解液、洗涤液稀释蛋白样品。
细胞裂解：

• 提取液制备：
  每500μL冷的裂解液中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  注：
  ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
  
• 取5～10×10⁶个细胞，在4℃，1000g条件下离心5～10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
  
• 用冷生理盐水洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
  注：
  ● 不要用Tris等缓冲液洗涤细胞。
  
• 每5×10⁶个细胞或100mg组织样本中加入500μL冷的蛋白裂解液，混匀后，用匀浆器充分匀浆，至无明显肉眼可见固体。
  注：
  ● 可以用液氮研磨。
  ● 可以用超声破碎细胞或其它细胞破碎仪充分破碎细胞。
  
• 将匀浆液在4℃条件下振荡15～30分钟。
  ● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
  ● 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
  
• 在4℃，14000g条件下离心15分钟。
  
• 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白裂解液。

二、柱平衡
加入500μL洗柱液洗柱，重力作用下或4℃下500×g力离心1分钟甩干吸附柱。
再次加入500μL洗柱液洗柱，重力作用下或4℃下500×g力离心1分钟甩干吸附柱。

三、上样
将以上蛋白裂解液或其它待富集蛋白样品加入吸附柱，重力作用下或4℃下500×g力离心1分钟甩干吸附柱。
注：
● 已经制备好的其它类型的待纯化蛋白样品，上样前要充分离心或过滤去除样品的沉淀，避免堵塞蛋白柱。

四、洗柱
加入300μL洗涤液洗柱，重力作用下或4℃下500×g力离心1分钟甩干吸附柱。
重复两次。

五、洗脱
加入300μL糖蛋白洗脱液，重力作用下或4℃下1000×g力离心1分钟甩干吸附柱，收集洗脱液。
再次加入300μL糖蛋白洗脱液，重力作用下或4℃下1000×g力离心1分钟甩干吸附柱，收集洗脱液，合并两次的洗脱液，即得到糖蛋白。
注：
● 如果需要浓度高的糖蛋白，可以不合并洗脱液，使用第一次的洗脱液，也可以合并后用蛋白浓缩柱进行浓缩。

六、柱保存和柱再生
载量大幅降低后，需要再生使用的柱子，可以用1mL 0.1M Tris-HCl（pH5.0）缓冲液洗柱，然后用300μL 0.5M NaOH含2M NaCl流洗，最后用500μL 20%乙醇洗即可。
然后在柱中加入20%乙醇溶液密封，置2～8℃保存。
再生使用时，加入500μL pH8.5磷酸盐缓冲液，浸泡蛋白柱填料30分钟，然后用2mL pH8.5磷酸盐缓冲液洗柱即可。
注：
● 糖蛋白纯化柱如果保存和处理得当的话可以多次重复使用。
● 未使用过的柱子直接室温或2～8℃避光保存。
● 短期保存使用过的柱子置2～8℃避光保存。
● 使用后需要长期保存时在柱中加入20%乙醇溶液密封，置2～8℃保存。

• 柱压升高，液体不流穿或较难离心下来？
  柱床被压缩或柱使用时间过长或样品固体杂质较多。
  注意上样样品要在16000×g离心15分钟，有条件可以用0.45μm膜过滤后再上样，不能将固体杂质上入蛋白柱。
  使用次数过多后要更换蛋白柱。

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