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GST Pull-Down实验基于谷胱甘肽-S-转移酶蛋白(GST)，可以与谷胱甘肽(GSH)结合，将GSH固定于磁珠上，形成GSH-磁珠，将已知蛋白X与GST融合表达，获得的GST-X蛋白可与GSH-磁珠结合，若体系中存在与X蛋白互做的蛋白Y，则会形成“磁珠-GSH-GST-X-Y”复合物，与X蛋白互做的蛋白即可被分离并检测。

6T为6次单组(1组实验或1组对照)pull-down实验，后面的操作步骤中包含了实验、对照各1组，需消耗2T试剂。

• 试剂盒内各组分请根据标签温度保存，部分组分需要避光保存，产品有效期见外包装。
  
• 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
  
• 样品保存时间不宜过久，新鲜的样本有利于实验的成功。
  
• 请勿干燥或剧烈涡旋磁珠，禁止长时间置于磁场，这些操作可能会引起磁珠聚团，降低结合活性。

• 蛋白提取(选做，若为2个重组蛋白验证互作则不做蛋白提取步骤，从B步骤开始)
  
  • 细胞样本：
    
    • 洗涤：预冷的1mL PBS洗涤样品(约2×10⁷个细胞)2次，最后一次尽量吸干PBS；
      
    • 裂解：根据细胞量加入990μL Lysis Buffer、10μL Protease Inhibitor(100×)，冰上充分裂解20～30min，每隔5min上下颠倒混匀1次;
      
    • 超声：用超声波细胞破碎仪超声5min，功率20%，超声3s，间歇3s，冰浴超声；
      
    • 离心：4℃下12000rpm，10min，收集上清。
  • 组织样本：
    
    • 研磨：取新鲜组织或低温组织(约0.3g)，置于灭菌后预冷的研钵中，用液氮研磨至粉状；
      
    • 裂解：取990μL Lysis Buffer，10μL Protease Inhibitor(100×)，混匀作为裂解液，吸取800μL裂解液加入研钵，在冰上继续研磨5～10min至样品成细腻的匀浆状，转移至新的1.5mL EP管中，再向研钵中加入剩余的200μL裂解液收集残留的样品，同样转移至该EP管；
      
    • 装有样品匀浆的EP管在冰上充分裂解30min，每隔5min上下颠倒混匀1次；
      
    • 超声：用超声波细胞破碎仪超声8～10min，功率20%，超声3s，间歇3s，冰浴超声；
      
    • 离心：4℃下12000rpm离心10min，收集上清，再向上清中加入Lysis Buffer补充体积至1mL，混匀。
      
      蛋白提取整个过程都在冰上操作，减少高温造成的蛋白降解，超声过程中最好不要有气泡产生，减少蛋白降解。总蛋白放在-20℃保存。
• GST Pull-Down
  
  • 磁珠准备：
    
    • 将Glutathione MagBeads从4℃冰箱取出，上下颠倒混匀数次，使磁珠和溶液混合均匀，分别取30μL到2个干净的1.5mL EP管中，记为对照和实验；
      
    • 加入0.5mL预冷的Washing Buffer重悬磁珠，置于磁力架上静置1min，分离磁珠和溶液，用移液枪小心吸弃上；
      
    • 重复上一步骤2次，共洗涤3次。
  • 磁珠结合GST-X蛋白：
    
    • 往实验组加入200μg GST-X重组蛋白，对照管不加蛋白或加入200μg GST重组蛋白；
      
    • 用Incubation Buffer补足体积至1mL，室温静音混合孵育2h；
      
    • 将2管置于磁力架上静置1min，分离磁珠和溶液，用移液枪小心吸弃上清；
      
    • 加入0.5mL预冷的Washing Buffer，置于磁力架上静置1min，分离磁珠和溶液，用移液枪小心吸弃上清；
      
    • 重复上一步骤2次，共洗涤3次。
  • 诱饵蛋白结合互作蛋白Y(除GST标签外的其他重组蛋白或总蛋白)：
    
    • 2管分别加入200μg Y重组蛋白或500～1000μg总蛋白，加Incubation Buffer将体积补至1mL，4℃静音混合孵育过夜(约16h)；
      
    • 将2管置于磁力架上静置1min，分离磁珠和溶液，用移液枪小心吸弃上清；
      
    • 加入0.5mL预冷的Washing Buffer，置于磁力架上静置1min，分离磁珠和溶液，用移液枪小心吸弃上清；
      
    • 重复上一步骤2次，共洗涤3次。
  • 洗脱：
    
    • 2管均加入100μL洗脱液，沸水浴10min，12000rpm离心5min，取上清，加入20μL 6×Loading Buffer，沸水浴8～10min，记为对照组和实验组；
      
    • 另取2支干净的1.5mL EP管，分别记为Input对照组，Input实验组，向Input对照组中加入GST重组蛋白和Y重组蛋白各50μg，向Input实验组中加入GST-X蛋白和Y重组蛋白各50μg(若为总蛋白则加入100μL)，加入1/5体积6×Loading Buffer，沸水浴8～10min。
      
    • 对照组、实验组、Input对照、Input实验置于-20℃保存备用。
• Western blot
  
  • 各取30μL对照、实验、Input对照Input实验，开展SDS-PAGE和Western blot检测。
• 银染(选做)
  
  • 取30μL对照、30μL实验、2μL Input对照、2μL Input实验，开展PAGE凝胶电泳。
    
  • 固定：将电泳后的凝胶从玻璃板上剥离下来，清水冲洗干净，放入干净的直径12cm玻璃皿中，加入去离子水没过胶，盖上盖子，在脱色摇床上室温摇晃5min，弃掉去离子水，加入固定液没过胶，盖上盖子，在脱色摇床上室温摇晃30min。
    
  • 致敏：弃掉固定液，加入去离子水没过胶，盖上盖子，在脱色摇床上室温摇晃5min，重复水洗一次，共2次，加入致敏液没过胶，盖上盖子，在脱色摇床上室温摇晃30min。
    
  • 染色：弃掉致敏液，加入去离子水没过胶，盖上盖子，在脱色摇床上室温摇晃2min，重复水洗一次，共2次，加入染色液没过胶，盖上盖子，在脱色摇床上室温摇晃20min。
    
  • 显色：弃掉染色液，加入去离子水没过胶，盖上盖子，在脱色摇床上室温摇晃1min，重复水洗一次，共2次，加入显色液没过胶，在脱色摇床上室温摇晃2min左右，溶液变浑浊，弃掉液体，加入新的显色液继续显色至目的条带清晰，拍照。
• 质谱(选做)
  
  • 取30μL对照和实验组蛋白样品开展LC-MS检测。